姜黄素下调miR-21-5p减轻缺氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞凋亡

谢瑾， 李红， 罗浩

（1.四川大学华西医院心内科，四川成都 610000；2.重庆医科大学第一附属医院心内科，重庆 400016）

心肌缺血再灌注损伤可导致心肌组织的严重损伤和功能障碍[1-3]。寻找用于防治心肌缺血再灌注损伤的有效药物一直是研究的热点。姜黄为姜科植物Curcuma longa L.的干燥根茎。性温，味辛、苦。有破血行气、通经止痛的功效，用于治疗胸胁刺痛、风湿肩臂疼痛、跌打肿痛等病症。姜黄素（curcumin）是从姜黄中提取的一种相对分子质量小的多酚类物质，通常认为它是姜黄中最有效的成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎和降血脂等作用[4-7]。已有研究表明，姜黄素对缺血再灌注大鼠心肌损伤具有保护作用[8]。基于此，本研究进一步观察姜黄素对缺氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞凋亡的影响，以期为开发和临床应用姜黄素治疗心肌缺血再灌注损伤提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞培养大鼠心肌细胞株H9C2来源于美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。细胞以含体积分数10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖DMEM培养基，于37℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。每2～3 d更换1次培养基。实验用细胞为处于对数生长期细胞。收集细胞时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化。

1.2药物与试剂姜黄素，购自中国食品药品检定研究院，批号：110823-201706。化学式：C21H20O6；分子量：368.38；纯度≥98.7%。Hoechst 33258染色液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、LipoRNAiTM转染试剂，均购自上海碧云天生物技术研究所；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青—链霉素，购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）细胞增殖及细胞毒性测定试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；荧光素酶检测试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；Bcl-2、Bax、caspase-3、GAPDH等抗体（美国Abcam公司）。

1.3仪器YKY-1200型荧光显微镜，购自上海永科光学仪器有限公司；Nanodrop®DR6000分光光度计，购自美国哈希公司；318C+酶标仪，购自上海沛欧分析仪器有限公司；GT9611型PCR仪，购自杭州柏恒科技有限公司；SmartGel凝胶成像仪，购自天津赛欧斯科技有限公司。

1.4姜黄素对缺血/复氧心肌细胞的影响

1.4.1 细胞模型建立[9]及分组 将对数生长期的H9C2细胞随机分为5组：空白对照组、缺氧/复氧组，姜黄素2.5、5、10μmol/L组[10]。除空白对照组外，其他各组用无糖DMEM培养基替换，置入体积分数5%CO2、95%N2的培养室内诱导缺氧4 h，再置于体积分数95%空气、5%CO2培育箱中复氧3 h，将无糖DMEM培养基替换回高糖培养基。姜黄素2.5、5、10μmol/L组于缺氧前在培养基中分别添加姜黄素2.5、5、10μmol/L，空白对照组、缺氧/复氧组不做其他处理。

1.4.2 MTT法测定细胞活力 H9C2细胞复氧培养24 h后，将细胞接种于96孔板（100μL/孔），每组设3个复孔，置于37℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱中培养24 h。每孔加入50μL MTT溶液，孵育4 h。吸出上清液，每孔加150μL二甲基亚砜（DMSO），用平板摇床摇匀。用酶标仪在570 nm波长处检测各孔光密度（OD，D）值。

1.4.3 LDH活性测定 H9C2细胞复氧培养24 h后，取细胞上清液，按照试剂盒说明书，测定LDH活性。

1.4.4 Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡 消化收集细胞，吸尽培养液，加入0.5 mL固定液，固定10 min或更长时间（可4℃过夜）。去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，弃液。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。去染色液，用PBS洗2遍，每次3 min，弃液。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。凋亡细胞的细胞核呈亮蓝色，亮蓝色斑点密度代表细胞凋亡程度。

1.4.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测心肌细胞缺氧/复氧条件下Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达水平 将待测细胞用PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。取等量的蛋白质样品（20 mg），100℃变性5 min。十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。体积分数5%BSA室温封闭1～2 h。加入相应的一抗（抗Bcl-2抗体：1∶1 000稀释；抗Bax抗体：1∶1 000稀释；抗caspase-3抗体：1∶1 000稀释；抗GAPDH：1∶10 000稀释），4℃过夜孵育。次日，清洗后再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。清洗，加入发光液。应用凝胶成像仪进行曝光拍照，并用Image J软件测灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。至少重复3次。

1.4.6 逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌细胞缺氧/复氧条件下miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平 用TRIzol试剂提取心肌细胞总RNA，用分光光度计测定总RNA的D260/D280，判定RNA纯度，计算出总RNA的含量。按照试剂盒说明书进行cDNA的合成和PCR的扩增，反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，扩增35个循环，72℃延长10 min。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离。以GAPDH为内参基因，2-△△Ct法计算miR-21-5p mRNA相对表达量。miR-21-5p上游引物序列为：5’-CGTTGA ATGTCACTCTGGTG-3’，下游引物序列为：5’-G GTCATTGTGTGCAGCTCAC-3’。Bcl-2上游引物序列为：5’-GGTGCCACCTGTGGTCCACCT-3’，下游引物序列为：5’-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3’。GAPDH上游引物序列为：5’-TGTGGGCATCA ATGGATTTGG-3’，下游引物序列为：5’-ACACC ATGTATTCCGGGTCAAT-3’。

1.5荧光素酶报告实验检测miR-21-5p与Bcl-2靶向关系通过TargetScan、mi Randa等靶基因预测软件分析miR-21-5p和Bcl-2存在3’UTR的结合位点。构建野生型和突变型的Bcl-2 3’UTR荧光素酶报告载体，分别命名为Bcl-2 wt和Bcl-2 mut。荧光素酶质粒由Invitrogen公司设计合成。将H9C2细胞接种于24孔板，细胞随机分为4组，即Bcl-2 wt+空质粒组、Bcl-2 wt+miR-21 mimic组、Bcl-2 mut+空质粒组、Bcl-2 mut+miR-21 mimic组，每组设3个复孔。Bcl-2 wt+空质粒组：将Bcl-2 wt和空质粒转染至H9C2细胞；Bcl-2 wt+miR-21 mimic组：将Bcl-2 wt和miR-21-5p mimic转染至H9C2细胞；Bcl-2 mut+空质粒组：将Bcl-2 mut和空质粒转染至H9C2细胞；Bcl-2 mut+miR-21 mimic组：将Bcl-2 mut和miR-21-5p mimic转染至H9C2细胞。应用lipofectamineTM2000转染48 h后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞双荧光素酶的活性。

1.6姜黄素对miR-21-5p mimic转染心肌细胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影响参照“1.4.1”项下方法，建立缺氧/复氧心肌细胞模型，将细胞随机分为4组：空白对照组、姜黄素组、mimic组和姜黄素+mimic组。姜黄素组于缺氧前在培养基中添加姜黄素10μmol/L；mimic组转染miR-21-5p mimic质粒；姜黄素+mimic组于缺氧前在培养基中添加姜黄素10μmol/L并转染miR-21-5p mimic质粒。RT-PCR检测miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平，Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡情况。

1.7姜黄素对si-Bcl-2转染心肌细胞Bcl-2蛋白表达及凋亡率的影响参照“1.4.1”项下方法，建立缺氧/复氧心肌细胞模型并将细胞随机分为4组：空白对照组、姜黄素组、si-Bcl-2组和姜黄素+si-Bcl-2组。姜黄素组于缺氧前在培养基中添加姜黄素10μmol/L；si-Bcl-2组转染si-Bcl-2质粒；姜黄素+si-Bcl-2组于缺氧前在培养基中添加姜黄素10μmol/L并转染si-Bcl-2质粒。以Western Blot法检测Bcl-2蛋白表达水平，Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡情况。

1.8统计方法采用SPSS18.0统计软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1姜黄素对缺血/复氧H9C2心肌细胞增殖活力及LDH活性的影响图1结果显示：与空白对照组比较，缺血/复氧组细胞活力显著降低（P＜0.01），LDH活性显著升高（P＜0.01）；与缺血/复氧组比较，姜黄素2.5、5、10μmol/L组细胞活力均升高，LDH活性均降低，并具有剂量依赖性，且姜黄素5、10μmol/L组差异有统计学意义（P＜0.01）。表明姜黄素可促进缺血/复氧心肌细胞的增殖活力，减轻细胞损伤。

图1 姜黄素对缺血/复氧H9C2心肌细胞增殖活力及LDH活性的影响Figure 1 The effect of curcumin on proliferative activity and LDH activity in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

图2 姜黄素对缺血/复氧H9C2心肌细胞凋亡率及凋亡相关蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2表达的影响Figure 2 The effect of curcumin on the apoptosis rate and expression of apoptosis-related proteins of caspase-3，Bax and Bcl-2 in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

2.2姜黄素对缺血/复氧H9C2心肌细胞凋亡率及凋亡相关蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的影响图2-A、-B结果显示：与空白对照组比较，缺血/复氧组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与缺血/复氧组比较，姜黄素2.5、5、10μmol/L组细胞凋亡率均降低，并呈剂量依赖性，且姜黄素5、10μmol/L组差异有统计学意义（P＜0.01）。图2-C、-D结果显示：与空白对照组比较，缺血/复氧组细胞caspase-3、Bax蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与缺血/复氧组比较，姜黄素2.5、5、10μmol/L组caspase-3、Bax蛋白表达水平降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），均呈剂量依赖性。表明姜黄素可抑制缺血/复氧心肌细胞凋亡。

2.3姜黄素对缺血/复氧H9C2心肌细胞miR-21-5p mRNA、Bcl-2 mRNA水平的影响图3-A结果显示：与空白对照组比较，缺血/复氧组miR-21-5p mRNA水平显著升高（P＜0.01）；与缺血/复氧组比较，姜黄素2.5、5、10μmol/L组miR-21-5p mRNA水平均显著降低，并呈剂量依赖性，且姜黄素5、10μmol/L组差异有统计学意义（P＜0.01）。图3-B结果显示：与空白对照组比较，缺血/复氧组Bcl-2 mRNA水平显著降低（P＜0.01）；与缺血/复氧组比较，姜黄素2.5、5、10μmol/L组Bcl-2 mRNA水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01），且呈剂量依赖性。表明姜黄素可降低miR-21及抗凋亡基因Bcl-2的表达。

图3 姜黄素对缺血/复氧H9C2心肌细胞miR-21-5p mRNA、Bcl-2 mRNA水平的影响Figure 3 The effect of curcumin on the miR-21-5p mRNA and Bcl-2 mRNA expression in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

2.4 miR-21-5p与Bcl-2靶向关系搜索NCBI数据库获得Bcl-2 3’UTR序列，结果如图4-A所示。采用荧光素酶报告实验验证，如图4-B结果显示：Bcl-2 wt+miR-21 mimic组荧光素酶活性较Bcl-2 wt+空质粒组、Bcl-2 mut+空质粒组、Bcl-2 mut+miR-21 mimic组显著降低（P＜0.01）。表明miR-21-5p和Bcl-2存在直接靶向作用关系。

图4 miR-21-5p与Bcl-2靶向关系Figure 4 Targeting relationship between miR-21-5p and Bcl-2

2.5姜黄素对miR-21-5p mimic转染后缺氧/复氧H9C2心肌细胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影响图5-A、-B结果显示：与缺血/复氧组比较，姜黄素组miR-21-5p mRNA水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平显著升高（P＜0.01）；与缺血/复氧组比较，mimic组miR-21-5p mRNA水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平显著降低（P＜0.01）；与mimic组比较，姜黄素10μmol/L+mimic组miR-21-5p mRNA水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平显著升高（P＜0.01）。图5-C结果显示：姜黄素组细胞凋亡率显著低于缺血/复氧组（P＜0.01），mimic组细胞凋亡率显著高于缺血/复氧组（P＜0.01），姜黄素10μmol/L+mimic组细胞凋亡率显著低于mimic组（P＜0.01）。表明姜黄素可靶向miR-21-5p抑制H9C2细胞凋亡。

图5 姜黄素对miR-21-5p mimic转染后缺氧/复氧H9C2心肌细胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影响Figure 5 The effect of curcumin on the mRNA expression levels of miR-21-5p and Bcl-2 and apoptosis rate in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes transfected with a mir-21-5p mimic

2.6姜黄素对si-Bcl-2诱导的缺氧/复氧H9C2心肌细胞Bcl-2蛋白表达及凋亡率的影响图6-A，-B结果显示：姜黄素组Bcl-2蛋白水平较缺血/复氧组显著升高（P＜0.01）；si-Bcl-2组Bcl-2蛋白水平较缺血/复氧组显著降低（P＜0.01），si-Bcl-2组Bcl-2蛋白水平显著低于姜黄素+si-Bcl-2组（P＜0.01）。图6-C结果显示：姜黄素组细胞凋亡率较缺血/复氧组显著降低（P＜0.01），si-Bcl-2组细胞凋亡率较缺血/复氧组显著升高（P＜0.01），姜黄素+si-Bcl-2组细胞凋亡率显著低于si-Bcl-2组（P＜0.01）。表明姜黄素促进Bcl-2蛋白表达，抑制si-Bcl-2诱导的心肌细胞凋亡。

图6 姜黄素对si-Bcl-2诱导的缺氧/复氧H9C2心肌细胞Bcl-2蛋白表达及凋亡率的影响Figure 6 The effect of curcumin on Bcl-2 protein expression and apoptosis rate in si-Bcl-2 transfected ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤后会发生4种类型的心功能障碍，包括无复流现象、心肌顿抑、再灌注心率失常和致死性再灌注损伤[11]。目前，对心肌缺血再灌注损伤的机制有不同的解释，如氧自由基理论[12]、钙超载理论[13]和炎症反应理论[14]。已有研究表明，心肌缺血再灌注损伤过程中会发生凋亡，凋亡在心肌最终梗死区域起决定性作用[15]。当使用特定药物干预凋亡过程时，有效抑制凋亡可使心肌梗死面积达到70%，显著改善心功能状态[16]。因此，在临床应用抗凋亡药物治疗心肌缺血再灌注损伤具有重要意义。LDH是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，其不能透过细胞膜，当靶细胞受损时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中。因此，检测LDH活性变化可反映细胞损伤情况[17]。本研究结果显示，心肌缺血再灌注损伤细胞的细胞增殖活力降低，LDH活性增加，而姜黄素具有升高缺血再灌注诱导的心肌细胞活力，减轻细胞损伤的作用。

细胞凋亡也称为程序性细胞死亡（PCD），而caspase-3是非常重要的起始因子[18]，其介导PCD过程。研究表明，caspase-3可以通过其自身的寡聚化切割而被激活，并且可以激活多种下游蛋白酶，并参与抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的过程[19]。下调caspase-3蛋白表达可保护心肌细胞免受缺氧/复氧损伤[20]。诱导凋亡级联的机制主要有内在途径和外在途径，内在凋亡途径中的关键事件是线粒体外膜的透化，其响应于各种刺激而发生，并且受若干细胞质蛋白调节[21]。促凋亡成员Bax位于线粒体外膜或细胞质，并在应激下寡聚化，促进线粒体释放因子，从而引发细胞凋亡[22]。

Bcl-2基因在细胞存活和凋亡抑制中起关键作用[23]。临床前研究表明，靶向抗凋亡Bcl-2家族成员的药物具有临床前活性[24]。抗细胞凋亡成员Bcl-2，可防止细胞凋亡。微小RNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其可以直接调控细胞中超过30%的基因[25]。miRNA还参与多种生物学过程，是细胞分化、生长、增殖和凋亡的主要调控因子[26]。研究发现，miR-21通过抑制缺氧/复氧诱导的自噬和细胞凋亡，从而预防心肌缺氧/复氧损伤[27]。miRNA可通过靶向Bcl-2调控心肌细胞凋亡[28-30]。

本研究结果显示，缺氧复氧诱导的H9C2细胞凋亡率及caspase-3、Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，姜黄素可下调缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡率及caspase-3、Bax蛋白水平，上调Bcl-2蛋白水平。表明姜黄素可抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡。

本研究通过生物信息预测和荧光素酶报告实验证实miR-21-5p和Bcl-2两者之间存在靶向关系。本研究结果显示，miR-21-5p mimic转染H9C2细胞后miR-21-5p表达升高，Bcl-2表达降低，凋亡率升高，而用姜黄素处理后miR-21-5p表达则降低，Bcl-2表达则升高，凋亡率降低，表明姜黄素可靶向miR-21-5p抑制H9C2细胞凋亡。通过构建小干扰RNA干扰Bcl-2的表达，发现姜黄素可升高Bcl-2表达，抑制si-Bcl-2诱导的H9C2细胞凋亡。说明姜黄素可通过下调miR-21-5p表达解除对Bcl-2的抑制，进而抑制H9C2细胞凋亡。

综上所述，姜黄素靶向miR-21-5p抑制缺血/复氧诱导的心肌细胞凋亡，通过下调miR-21-5p表达解除对Bcl-2的抑制，从而保护心肌细胞。