不同品牌酶联免疫吸附法试剂检测饲料中赭曲霉毒素A的研究

2020-07-09宋晓东马文丽

粮食与饲料工业 2020年2期

宋晓东,马文丽,赵媛

(内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特 011500)

赭曲霉毒素(ochratoxins)是由多种曲霉和青霉菌产生的一类化合物，依其发现顺序分别称为赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC),其中以赭曲霉毒素A的分布最广泛，毒性最强，对人类和动物的危害最大[1]。主要以污染小麦、玉米、大米等农作物为主[2]。

目前，检测饲料中赭曲霉毒素A残留的检测方法主要有薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联机、酶联免疫吸附测定法等[3-9]。其中酶联免疫吸附测定法，具有灵敏度高、特异性强、速度快和成本低的优点；可以高通量的对大量样品进行常规分析；能够用于样品的定量测定，以确定样品中待测组分的含量。

本研究对于市售不同品牌酶联免疫吸附法试剂盒在线性关系、回收率、精密度和抗干扰等方面检测玉米粉中赭曲霉毒素A残留对比，为乳制品企业选择快速筛查饲料方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AL204电子天平，梅特勒-托利多(中国)公司；A11basic研磨仪，德国ZKA公司;ELx808酶标仪;15R高速冷冻离心机;2000237电热恒温培养箱；MS3 basic振荡器；N-EVAP 112氮吹仪；BRAND(10～100)μl、(100～1 000)μl单道移液器、(30～300)μl多通道移液器;25 ml移液管、50 ml移液管。

赭曲霉毒素A标准物质，纯度>99.5%；甲醇，分析纯；磷酸，分析纯；二氯甲烷，分析纯；正己烷，分析纯。

赭曲霉毒素A ELISA检测试剂盒,品牌M试剂厂家；赭曲霉毒素A ELISA检测试剂盒,品牌E试剂厂家；赭曲霉毒素A ELISA检测试剂盒,品牌P试剂厂家。

1.2 样品制备

准确称取样品后，按照不同品牌试剂盒的前处理方法及操作方法进行检测。

1.2.1品牌M试剂样品制备方法

(1)粉碎并称取4.0 g有代表性的样本置入50 ml离心管中，加入60%甲醇20 ml与其混合。

(2)于振荡器上剧烈振荡10 min，转速为150 r/min。

(3)于4 000 r/min离心5 min。

(4)取上清100 μl加入900 μl样本稀释液，振荡5 s，取50 μl用于分析。

1.2.2品牌E试剂样品制备方法

(1)取大约50 g样品磨成粉末状，取5 g样品于干净试管中，加10 ml 0.5 mmol/L磷酸溶液，充分混合10 min。

(2)加20 ml二氯甲烷，3 000 g，离心10 min。

(3)去除上层磷酸层，旋涡混合溶液，3 000 g，离心10 min。

(4)取下层溶液(二氯甲烷层)用滤纸过滤，吸取12 ml滤液，50℃氮流蒸发。

(5)残留物溶解于1.5 ml的试剂盒自带抽提缓冲液A中。

(6)加2 ml正己烷，混合1 min，3 000 g，离心10 min，去除上层正己烷层。

(7)吸取50 ml下层清夜与200 ml稀释缓冲液，混合均匀，吸取50 ml用于检测。

1.2.3品牌P试剂样品制备方法

(1)将样品研磨成粉末,称取20 g研磨的样品，加入100 ml萃取剂(70%甲醇),涡旋混合至少2 min。

(2)待混合物中的颗粒沉淀后，定性滤纸过滤5～10 ml萃取液，收集滤液，取50μL滤液直接用于检测。

1.3 检测方法

根据不同品牌赭曲霉毒素A酶联免疫检测试剂盒说明书进行操作,并用试剂盒专业的分析软件进行结果分析。

1.4 回收率试验

准确称取1 g阴性玉米粉样品12份,分成3组，每组4份，于每组中分别加入赭曲霉毒素A标准品，进行3个不同浓度范围的加标试验，按照不同品牌试剂盒操作方法进行检测，并计算每种试剂盒检测样品的回收率。

1.5 精密度试验

准确称取1 g阴性玉米粉样品20份,向其中加入赭曲霉毒素A标准品，配制成5 μg/kg浓度水平样品，按照不同品牌试剂盒操作方法进行检测，并计算每种试剂盒检测样品的相对标准偏差(RSD)。

1.6 抗干扰试验

准确称取1 g阴性玉米粉样品6份,分成3组，每组2份，于每组中加入抗生素类、掺假物、混合毒、金属元素(钙、镁、钠元素)等干扰物质，并于每组样品中其中1份样品加入赭曲霉毒素A标准品配制成5 μg/kg浓度水平样品，按照不同品牌试剂盒操作方法进行检测，并计算每种试剂盒检测样品的干扰物回收率。

1.7 适用性试验

采用3种品牌试剂盒对配合饲料、浓缩饲料、精料补充料3种不同饲料，在2、5、10 μg/kg 3个添加浓度水平进行添加回收率试验，按照不同品牌试剂盒操作方法进行检测，并计算每种试剂盒检测样品的回收率及相对标准偏差(RSD)。

1.8 准确性试验

选取阴性玉米粉样品,向其中加入赭曲霉毒素A标准品，配制成10 μg/kg浓度水平样品，分别采用前述3种品牌试剂盒和GB/T 30957—2014饲料中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法进行检测，每种样品重复检测6次，比较3种品牌试剂盒检测方法和高效液相色谱法检测结果差异。

2 结果与分析

2.1 定量限及线性关系

根据不同品牌试剂盒检测方法的标准曲线相关信息可知，品牌E、P试剂盒相关系数R2均大于0.96，且定量限均为1.5 μg/kg，具有良好的线性关系，定量限及线性关系对比如表1。

表1 定量限及线性关系对比

2.2 回收率

选取阴性玉米粉样品进行3个不同浓度范围的加标实验，按照不同品牌试剂盒操作方法进行检测，重复6次，经计算得出不同加标回收率结果见表2。加标浓度为2～10 μg/kg时，品牌M试剂盒检测的回收率为5%～174%；品牌E试剂盒检测的回收率为4%～86%；品牌P试剂盒检测的回收率为96%～124%，由此可知，品牌P试剂盒检测回收率较好，满足检测要求。

表2 回收率试验结果对比(n=6)

2.3 精密度

精密度试验结果见表3。

表3 精密度试验结果(n=20)

选取阴性玉米粉样品进行同一浓度的加标试验，按照不同品牌试剂盒操作方法进行检测，重复20次，经计算得出各个试剂盒检测样品的相对标准偏差，结果如表3所示。加标浓度为5 μg/kg时，品牌M试剂盒检测的相对标准偏差(RSD)值为110.5%；品牌E试剂盒检测的相对标准偏差值为11.6%；品牌P试剂盒检测的相对标准偏差值为7.9%，由此可知，品牌P试剂盒检测精密度较好，满足检测要求。

2.4 抗干扰

选取阴性玉米粉样品进行相同浓度加标试验，按照不同品牌试剂盒操作方法进行检测，重复6次，经计算得出同一加标干扰物回收率结果如表4所示。加标浓度为5 μg/kg时，品牌M试剂盒检测的干扰物回收率为45%；品牌E试剂盒检测的干扰物回收率为65%；品牌P试剂盒检测的干扰物回收率为79%，由此可知，品牌P试剂盒检测干扰物回收率较好，满足检测要求。

表4 抗干扰试验结果对比(n=6)

2.5 适用性

选取3种不同饲料进行3个不同浓度范围的加标试验，按照不同品牌试剂盒操作方法进行检测，重复6次，经计算得出不同加标回收率结果见表5。

加标浓度为2～10 μg/kg时，品牌M试剂盒检测配合饲料的回收率为15%～84%,相对标准偏差为25%～95%,检测浓缩饲料的回收率为8%～78%,相对标准偏差为15%～115%,检测精料补充料的回收率为20%～88%,相对标准偏差为15.3%～88%；品牌E试剂盒检测配合饲料的回收率为26%～98%,相对标准偏差为9.8%～10.3%,检测浓缩饲料的回收率为34%～83%,相对标准偏差为11.5%～22%,检测精料补充料的回收率为12%～89%,相对标准偏差为6.7%～16.5%；品牌P试剂盒检测配合饲料的回收率为98%～112%,相对标准偏差为5.9%～8.1%,检测浓缩饲料的回收率为98%～106%,相对标准偏差为6.8%～8.8%,检测精料补充料的回收率为109%～129%,相对标准偏差为4.9%～8.7%；由此可知，品牌P试剂盒检测回收率较好，均在98%～129%之间，且相对标准偏差低于10%，满足检测要求。

因此，品牌P试剂盒检测方法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料等3种不同饲料中赭曲霉毒素A含量的测定。

表5 适用性试验结果对比(n=6)

2.6 准确性

选取阴性玉米粉样本，分别采用高效液相色谱法和前述3种品牌试剂盒方法进行检测，每种方法对每个样品进行6次平行测定，并取平均值，计算每种试剂盒方法与高效液相色谱法相对标准偏差，结果见表6。品牌M试剂盒方法检测结果与HPLC方法检测结果相对标准偏差为39.2%，品牌E试剂盒方法检测结果与HPLC方法检测结果相对标准偏差为2.0%，品牌P试剂盒方法检测结果与HPLC方法检测结果相对标准偏差为0.58%，由此可知，品牌P试剂盒方法准确性较好。