高效液相色谱法测定预混合饲料中的25-羟基维生素D3

2020-07-09张浩然张亦菲华贤辉

粮食与饲料工业 2020年2期

张浩然，张亦菲，徐汀，田恺，华贤辉，商军

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

25-羟基维生素D3也叫25-羟胆钙化(固)醇、钙二醇或简写为25-OH-D3，是维生素D3机体内的第1个代谢产物，其在肝细胞微粒体和线粒体中25-羟化酶的作用下，脱氢生成，是维生素D3在血浆循环中的主要形式[1]，因此，与维生素D3相比，更容易被吸收[2]。研究表明，在家禽饲料中添加一定量的25-OH-D3可起到提高家禽的体增重、胸肉率及免疫力等作用[3-4]，还能够提高蛋壳质量[5]；在猪日粮中添加一定量的25-OH-D3可以改善肉质，提高母猪怀孕率及窝产仔数[6-7]，其生物学效价是维生素D3的2倍[8]。目前，25-OH-D3已获我国农业农村部第2625号公告和欧洲食品安全局(EFSA)批准可以在猪和家禽饲料中使用的新型营养型添加剂，并且都规定了其在配合饲料或全混合日粮中的最高限量：猪为50 μg/kg，肉鸡、火鸡为100 μg/kg、其他家禽为80 μg/kg[9]，其在畜禽养殖业中也得到了广泛的应用。

目前国内外文献报道主要为血清中25-OH-D3含量的测定[10-13]，鲜有饲料中25-OH-D3含量测定的报道，配合饲料中添加的25-OH-D3主要来源于预混合饲料，有必要建立预混合饲料中25-OH-D3含量测定的可靠方法，为此，建立并优化了高效液相色谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

25-OH-D3标准品，质量分数为98.2%，批号为G155330，德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇为色谱纯；试验用水均为一级水；预混合饲料样品来自于市场收集。ACQUITY Arc高效液相色谱仪，美国Waters公司，配Empower 3软件；AB265-S电子天平(精度为0.01 mg)，梅特勒-托利多(中国)；Molatom 1810A型纯水机，重庆摩尔水处理设备有限公司。

1.2 样品的前处理

称取预混合饲料3 g(精确至0.01 mg)于50 ml棕色容量瓶中，加水10 ml，超声10 min，待温度降至室温后，加入30 ml甲醇，震荡混匀，超声提取20 min，冷却至室温后，用甲醇定容至刻度。再取30 ml于离心管中，以9 000 r/min的转速离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待上机。

1.3 色谱条件

色谱柱：Thermo AQUASIL-C18，柱长100 mm，内径3.0 mm，粒径3 μm；柱温：30℃；流动相：A相为水，B相为甲醇，梯度洗脱程序见表1；检测波长 264 nm；进样量 50 μl。

1.4 标准储备溶液制备

称取25-OH-D3标准品25 mg(精确至0.01 mg)至25 ml棕色容量瓶中，振摇使25-OH-D3完全溶解，用甲醇定容。于-20℃下保存。

1.5 标准系列溶液制备

用85%甲醇溶液将标准储备溶液逐级稀释至棕色容量瓶中，使浓度分别为25.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.05 μg/ml。临用现配。

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件

根据相关文献报道，高效液相色谱法测定25-OH-D3多用甲醇和水作流动相[14-15]。由于预混合饲料基质复杂，存在极性较弱的强保留物质，故本方法采用表1梯度洗脱进行分析，确保目标分得到有效分离并尽可能缩短分析时间。此外，本方法不会受到预混合饲料中常见的其他脂溶性维生素的干扰，典型色谱图见图1、图2。

表1 梯度洗脱表

图1 25-OH-D3，维生素A，维生素D3及维生素E标准品溶液的色谱图

图2 预混合饲料样品溶液的色谱图

2.2 提取剂的筛选

向空白基质中进行浓度为10 mg/kg的添加，称取3 g于50 ml容量瓶中，加水10 ml，超声处理10 min，冷却至室温后，选取不同提取剂加入30 ml，超声提取20 min，冷却至室温后，用相应提取剂定容至刻度。取30 ml，离心(9 000 r/min，5 min)取上清液(如提取剂与水分层，则取有机层1 ml，氮吹至干后，用1 ml 85%甲醇复溶)，过0.22 μm滤膜，上机测定。结果表明，甲醇的回收率为88.9%。将甲醇提取后的残渣进行2次提取，残渣中未检出25-OH-D3，说明甲醇的提取效率较高，故确定甲醇为提取剂，提取1次，结果见表2。

2.3 方法的线性与范围

根据市售预混合饲料样品实际情况，25-OH-D3的含量主要在(2～300)mg/kg。按照本文确定的方法进行前处理，得到待测样品溶液的浓度在(0.12～18)μg/ml。故本方法选择浓度为(0.05～25)μg/ml，以浓度(x)为横坐标，相应峰面积(y)为纵坐标绘制标准工作曲线。线性方程为y= 13 486x-11 670，相关系数为0.999 8。结果表明，本方法在浓度为(0.05～250)μg/ml时，线性良好。

表2 不同提取剂提取效率考察结果(n=5)

2.4 方法的检测限和定量限

在空白基质中添加一定浓度的25-OH-D3对照品，按照本方法的前处理及分析方法进行试验，并依据信号与噪声比例(s/n)，即s/n≥3的浓度为检出限，s/n≥10的浓度为定量限的原则，确定了本方法的检出限为0.2 mg/kg，定量限为1 mg/kg，结果见图3和图4。

图3 空白预混合饲料基质中添加0.2 mg/kg(s/n ≥3)的色谱图

图4 空白预混合饲料基质中添加1 mg/kg(s/n ≥10)的色谱图

2.5 方法的准确度和精密度

考虑到预混合饲料样品中25-OH-D3含量分布范围较大，故选取空白基质，加入一定浓度25-OH-D3对照品，分别从1、10、50、200 mk/kg四个不同浓度水平考查准确度及精密度。试验结果表明，4种不同浓度添加的批内回收率为72.2%～104.2%，批内RSD为1.0%～5.3%；批间回收率为75%～103%，批间RSD为1.3%～4.4%。方法的回收率及精密度均符合GB/T 23182—2008《饲料中兽药及其他化学物检测试验规程》要求，结果见表3。

表3 方法准确度及精密度的试验结果(n=5)

2.6 方法的耐用性

2.6.1柱温对测定的影响

选择实际样品，25-OH-D3标示量为2.5 mg/kg。按照本文的仪器条件，调整柱温，在25～35℃考察柱温对测定结果的影响。结果表明，柱温在25、30及35℃时，测定的25-OH-D3含量结果相对标准偏差为2.4%，说明柱温在25～35℃的变化，对25-OH-D3含量测定结果无影响，结果见表4。

表4 不同柱温对25-OH-D3含量测定结果的影响(n=3)

2.6.2色谱柱对测定的影响

选择实际样品，25-OH-D3标示量为2.5 mg/kg。按照本方法的仪器条件，更换色谱柱，考察不同色谱柱对测定结果的影响。结果表明，使用不同色谱柱进行测定时，结果的相对标准偏差为2.6%，表明不同色谱柱对测定结果无影响,结果见表5。

表5 不同色谱柱对25-OH-D3含量测定结果的影响(n=3)

2.7 方法的基质效应考察

2.7.1不同载体对25-OH-D3含量测定的影响

实际生产中，为了能够更好承载其活性成分，提高化学稳定性和分散性，25-OH-D3有不同种类的饲料载体。因此，应考察常见载体对25-OH-D3含量测定的影响。选取不同载体进行浓度为10 mg/kg的添加，按照本文规定的方法进行试验，通过回收率，考察本方法对于不同载体中25-OH-D3的提取效率。结果表明,回收率均大于90%，表明本方法适用于不同载体，结果见表6。

2.7.2不同基质对25-OH-D3含量测定的影响

市售预混合饲料种类繁杂是其基质复杂的原因之一。应对常见的不同预混合饲料基质进行考察，包括猪用、禽用及水产用预混合饲料。选取不含有25-OH-D3的空白基质，进行浓度为10 mg/kg的添加，按照本研究规定的方法进行试验，通过回收率，考察本方法对于不同基质中25-OH-D3的提取效率。结果表明，回收率均大于83%，表明本方法适用于不同基质，结果见表7。

表6 不同载体中25-羟基维生素D3提取效率考察数据表(n=3)

表7 不同基质中25-羟基维生素D3提取效率考察数据表(n=3)

2.8 样品测定

为了进一步考察方法适用性，按本文方法对市场收集的各类预混合饲料产品进行了测定。为保证测定结果的准确性，对收集的共计16批的禽用及猪用预混合饲料进行了测定，并对每个试样进行了本底加标测定。结果表明，禽用预混合饲料的测定结果在(3.3～273.5)mg/kg，本底加标回收率在86.1%～110.2%；猪用预混合饲料的测定结果为(2.2～81.3)mg/kg，本底加标回收率为86.5%～104.1%。表明，建立的方法适用于预混合饲料中25-OH-D3的测定，结果见表8。