毛水苏组织培养技术研究

金 琼， 刘 悦， 刘德江， 申 健

(1.佳木斯大学生命科学学院， 黑龙江 佳木斯 154007； 2.牡丹江市第十五中学， 黑龙江 牡丹江 157000)

毛水苏(StachysbaicalensisFisch.ex Benth.)为唇形科水苏属多年生草本植物，别名水苏草、野紫苏、山升麻等，是国家重点保护兼蜜源植物。毛水苏分布在我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙、山东、山西、陕西等地，多呈零星分布[1]。毛水苏作为一种中药，全草及根入药，具有祛风解毒，止血之功效。此外，毛水苏花期长，流蜜量大，蜜色洁白透明，气味纯正芳香，低温不易凝稠结晶，其质量仅次于椴树蜜，是一种经济价值高有发展前景的蜜源植物[2]。

毛水苏喜湿润肥沃土壤，天然多分布在湿地杂草稀疏的隙地和河床边缘的河滩地，曾经是遍布三江平原的典型地域性植物[1]。然而经过多年的围垦造田，截流改河道，盲目开发湿地等，毛水苏近30年来大面积消失，濒临灭绝。在对破坏生态为代价发展经济的反思后，生态文明建设纳入国家总体战略布局。国家对三江湿地珍贵濒危植物的恢复非常重视，2016年已批复在三江湿地核心区——大佳河湿地试验区投入1 000余万元恢复毛水苏[3]。可以预见，毛水苏的恢复与发展不但可再现往年湿地盛景，在一定程度上也为东北黑蜂种群的存续繁衍提供雄厚的物质基础。

毛水苏根蘖和种子均可繁殖，但具有种子不便采收，根蘖繁殖数量有限等缺点。采用植物组织培养方法繁殖幼苗，可以缩短繁殖周期，扩大繁殖数量[4]，加大其植株储备量。本试验的目的是筛选出适合毛水苏快速繁殖的组织培养技术，为湿地植被恢复及毛水苏的开发利用提供材料及技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为野生毛水苏植株，取材于饶河县大佳河湿地。选取长势粗壮，无病虫害的植株茎段作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1外植体消毒处理

挑选长势一致的植株，剪去叶片，保留叶柄基部，用软毛刷加洗洁精刷洗1次，然后用自来水流水冲洗1 h，75%乙醇浸泡30 s后用无菌水冲洗3～4次[5]。最后用0.1%HgCl2溶液加5滴吐温80浸泡5 min，无菌水冲洗3～4次后备用。

1.2.2基本培养基的筛选

在WPM，MS，1/2 WPM，1/2 MS 4种培养基上分别接入茎段外植体，每种培养基接10瓶，每瓶接5个外植体，观察茎段腋芽生长情况，20 d后统计萌芽率和芽长，筛选出适宜基本培养基。

萌芽率(%)=(萌芽数/外植体的总数)×100%。

1.2.3不同植物激素对不定芽增殖的影响

在筛选出的基本培养基中分别加入6-BA(0.5，1.0，1.5 mg·L-1)，NAA(0.01，0.05，0.10 mg·L-1)，2,4-D(0.2，0.4，0.6 mg·L-1)及IBA(0.01，0.05，0.10 mg·L-1)，将腋芽接入培养基中，每个处理接10瓶，每瓶接5个腋芽。20 d后统计芽增殖系数及芽长，筛选出较适宜的激素种类。然后进行正交试验，研究几种激素组合作用效果，正交试验因素水平见表1。

芽增殖系数=再生丛生芽总数/接种腋芽总数。

表1 正交试验因素水平

水平因 素6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)IBA/(mg·L-1)10.50.010.0121.00.050.0531.50.100.10

1.2.4最佳生根培养基筛选

将增殖获得的丛生芽切成1.0 cm左右高的不定芽，接种于不同的生根培养基中进行培养，每瓶接种5个不定芽，每个处理接种10瓶。选择1/2 WPS为基本培养基，分别附加3个IBA浓度梯度0.05、0.10、0.15 mg·L-1，3个NAA浓度梯度0.10、0.20、0.30 mg·L-1，共6个处理。30 d后统计生根率、生根数、根长、芽长以及生长情况等。

以上增殖培养基附加蔗糖30 g·L-1，生根培养基附加蔗糖20 g·L-1，琼脂7 g·L-1，pH调至6.0，121 ℃灭菌20 min。培养温度为(25±2)℃，光照强度为1 200～1 500 lx，光照时间12 h·d-1[6]。

1.2.5生根苗与不生根苗移栽比较

将生根良好的组培苗从培养室取出，置于室内光照下炼苗3 d，打开瓶口2 d后进行移栽。从瓶中小心取出小苗，用20 ℃左右温水洗净在根系上附着的培养基，然后迅速移栽入塑料穴盘中。移栽基质为田园土∶粗沙∶腐殖土=1∶1∶1。移栽初期注意增大湿度并遮阴，移栽30 d后调查移栽成活率、株高及生长情况。将未经过生根培养的苗同时进行移栽，比较生根苗和不生根苗的生长差异。

1.3 数据分析

采用Excel 2007软件进行数据处理，采用SPSS 16.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 基本培养基的筛选结果

接种20 d后，观察茎段腋芽生长情况，结果见表2。

4种基本培养基中的毛水苏均可从叶腋处长出不定芽，由于培养基中未添加植物激素，所以没有出现增殖现象。由表2可知：WPM培养基的萌芽率最高，为188.00%，显著高于其他3种培养基。WMP和MS培养基的芽长无显著性差异，但显著高于另外2种培养基。WPM培养基中芽长最大，为2.86 cm。从长势上看，WPM培养基中的不定芽生长得较粗壮，颜色浓绿。1/2 WPM培养基中的不定芽颜色黄白，茎纤细。MS和1/2 MS培养基中的不定芽生长得纤细，颜色黄绿到黄白，且有玻璃化现象出现。所以，选择WPM培养基作为基本培养基。

表2 不同基本培养基对毛水苏腋芽生长的影响

基本 培养基 萌芽率/%芽长/cm生长状况 WPM188.00±4.00a2.86±0.15a颜色浓绿,茎粗壮MS156.67±4.23b2.78±0.21a颜色黄绿,茎纤细,有玻璃化现象1/2WPM123.33±2.54c2.25±0.11b颜色黄白,茎纤细1/2MS118.00±2.05c2.07±0.08b颜色黄白,茎纤细,有玻璃化现象

注：同列不同字母表示差异显著(p<0.05)。下同。

2.2 不同植物激素对不定芽增殖的影响

在WPM培养基中添加不同种类和浓度的植物激素，将组织培养中诱导出的腋芽接种于不同培养基中，不同植物激素对不定芽增殖的影响见表3。

表3 不同植物激素对毛水苏腋芽增殖效果的影响

激素种类 浓度/(mg·L-1) 芽增殖系数芽长/cm6-BA0.502.16±0.13c3.45±0.21a6-BA1.003.76±0.19a3.38±0.19a6-BA1.502.68±0.17b3.42±0.22aNAA0.011.76±0.11d3.37±0.17aNAA0.051.28±0.09e3.31±0.14aNAA0.101.56±0.10de3.33±0.15a2.4-D0.200.00±0.00g0.00±0.00b2.4-D0.400.00±0.00g0.00±0.00b2.4-D0.600.00±0.00g0.00±0.00bIBA0.011.04±0.05ef3.40±0.22aIBA0.051.56±0.08de3.36±0.17aIBA0.101.10±0.05ef3.38±0.21a

培养中观察到，添加激素2,4-D的培养基中不定芽全部死亡，其他3种激素培养基中有不同程度的增殖。添加6-BA的培养基中增殖系数最大，显著高于另外2种激素。添加6-BA的3个处理间增殖系数有显著性差异，6-BA 1.00 mg·L-1的处理增殖系数最大，为3.76。从芽长看，3种激素各处理间差异不显著。这说明所选激素对增殖系数产生了差异影响，对芽长没有差异影响。

将6-BA、NAA和IBA 3种激素进行正交试验，研究其混合效果，结果见表4。

通过试验结果分析可知：A2为A因素的优水平，B1为B因素的优水平，C2为C因素的优水平。3个因素的优水平组合为A2B1C2，即毛水苏不定芽增殖的最佳激素浓度组合为6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1，增殖系数为2.36。因为RA>RC>RB，所以，3个因素对增殖系数的影响主次顺序为A、C、B，即6-BA最大，其次是IBA，而NAA最小。

表4 正交试验优化增殖培养基试验结果

水平因 素6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)IBA/(mg·L-1)增殖系数11.001.001.001.6521.002.003.001.4831.003.002.001.7642.001.002.002.3652.002.001.002.0362.003.003.002.1173.001.003.001.8183.002.002.001.8493.003.001.001.76K11.631.941.81K22.171.781.99K31.801.881.80R0.540.160.19

注：K值为同一水平的平均值，R为极差。

图1 毛水苏增殖培养

2.3 最佳生根培养基的筛选结果

将增殖培养出的丛生芽接种到生根培养基中，30 d后观察生根情况，结果见表5。

培养中发现，毛水苏是极易生根植物，所选激素及浓度均可生根，生根率93.85%～100%，各处理间无显著性差异。NAA 0.30 mg·L-1的处理生根数最多，平均4.17条，显著高于其他处理。NAA 0.30 mg·L-1和0.20 mg·L-1处理根长最长，此2个处理根长差异不显著，但显著高于其他处理。NAA各处理间芽长无显著性差异，但显著高于IBA各处理的芽长。IBA各处理间芽长无显著性差异。综合考虑，NAA更适合在毛水苏组培苗生根培养基中使用，使用浓度为0.30 mg·L-1。

表5 不同植物激素对毛水苏生根效果的影响

激素浓度/(mg·L-1)生根率/% 生根数/条根长/cm芽长/cmIBA0.0594.36±1.65a1.74±0.11d 1.75±0.07c 3.35±0.21bIBA0.1096.51±1.27a2.56±0.21c 2.15±0.09b3.42±0.18bIBA0.1593.85±1.88a1.85±0.18d2.24±0.05b3.56±0.16bNAA0.1098.25±1.34a2.98±0.15b2.26±0.06b3.79±0.22aNAA0.20100.00±0.00a3.05±0.27b3.32±0.22a3.86±0.25aNAA0.30100.00±0.00a4.17±0.35a3.58±0.46a3.88±0.22a

图2 毛水苏生根培养

2.4 生根苗与不生根苗移栽比较

将组织培养中生根苗及未经生根培养的苗同时移栽，30 d后观察生长情况，结果见表6。

表6 生根苗与不生根苗栽培比较

成活率/%株高/cm生长状况生根苗100.00±0.00a8.56±0.350a缓苗快,植株健壮,颜色浓绿不生根苗71.36±3.65b6.21±0.026b缓苗慢,植株健壮,颜色淡绿

由表6可知，毛水苏是极易成活植物，生根苗移栽成活率100%，即使没有经过生根培养的苗，移栽后成活率也能达到71.36%。生根苗移栽后缓苗快，植株健壮，颜色浓绿，株高可达8.56 cm。不生根苗移栽后缓苗慢，颜色淡绿，株高6.21 cm。

3 讨论与结论

WPM和MS培养基是植物组织培养中常用的基础培养基，一般木本植物多选择WPM培养基[7]，草本植物多选择MS培养基。本试验中，不添加任何植物激素条件下，WPM培养基更适合毛水苏组织培养，萌芽率高，植株生长健壮，颜色浓绿，未出现玻璃化现象，这说明WPM也不局限于木本植物使用。

单因素试验表明：6-BA对毛水苏增殖培养效果最好。添加6-BA 1.00 mg·L-1的处理增殖系数最大，为3.76。正交试验结果表明：6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1对毛水苏增殖培养效果最好，增殖系数为2.36。从增殖系数大小看，3种激素的组合不如单独使用6-BA的效果好，但比单独使用NAA或IBA效果好。所以，可选择WPM+6-BA 1.00 mg·L-1作为毛水苏的增殖培养基使用。正交试验表明，3个因素主次顺序为6-BA最大，其次是IBA，而NAA最小。这与单因素试验中6-BA效果优于其他两种激素相吻合。

毛水苏是极易生根植物，在试验所选激素及浓度条件下均可生根，生根率为93.85%～100%。综合考虑生根率、生根数、根长和芽长等指标，认为毛水苏组培苗生根培养基为1/2 WPM+NAA 0.30 mg·L-1。鉴于毛水苏易生根特性，试验中进行了生根苗和不生根苗移栽比较，从移栽成活率看，生根苗成活率100%，不生根苗成活率71.36%。生根苗移栽缓苗期短，植株生长快，同期株高明显高于不生根苗。但从生产周期和成本角度考虑，如果省略生根培养环节，可以缩短20～30 d的培养时间，同时节省培养中所需试剂、水、电、人工等各方面的成本。虽然不生根苗移栽成活率低于生根苗，但如果大量工厂化生产，从节省成本，创造更大经济效益角度考虑，可以省去生根培养环节，直接将增殖培养出的苗进行移栽。