促红素新型环性衍生肽对顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用*

王 锋，王熙坚，戴厚永，范亚平，杨 斌

（南通大学附属医院肾内科，江苏226001）

随着抗肿瘤药物、抗生素、造影剂等的广泛应用，药物引起的急性肾损伤（AKI）呈逐年上升趋势。顺铂是很多实体肿瘤化疗方案的基本药物，抗肿瘤效率高，但顺铂及其代谢物可通过有机阳离子转运蛋白被肾小管上皮细胞吸收，诱导肾小管上皮细胞的凋亡和坏死，从而导致AKI，有效缓解顺铂的肾毒性可以提高肿瘤患者的化疗质量[1]。促红素新型线性衍生肽（helix B surface peptide，HBSP）对顺铂所致AKI 的保护作用在动物模型中已得到验证[2]，本研究通过探讨促红素新型环性衍生肽（cyclic helix B peptide，CHBP）对顺铂诱导的 NRK-52E 损伤的影响及其可能的作用机制，为临床缓解顺铂肾毒性提供新的治疗思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 NRK-52E 细胞（由南京医科大学附属第二医院肾内科赠送）；CHBP（上海科肽生物科技有限公司）；顺铂注射液（6 mL：30 mg）（中国江苏豪森药业集团有限公司）；DMEM-F12 培养基（美国HYCLONE 公司）；小牛血清（德国CapricornScientific公司）；PBS、青链霉素溶液（中国碧云天生物有限公司）；0.25%胰酶-EDTA（美国THERMO 公司）；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（中国凯基生物有限公司）；流式细胞仪（BriCyte E6）（中国mindray公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组：体外培养NRK-52E 细胞分为三大组，（1）对照组：NRK-52E 细胞（4×105）单纯培养；（2）顺铂组：10 μmol/L 顺铂处理 NRK-52E 细胞；（3）CHBP 干预组：①低浓度亚组：16 nmol/L CHBP+10 μmol/L 顺铂处理NRK-52E 细胞；②中浓度亚组：32 nmol/L CHBP+10 μmol/L 顺铂处理 NRK-52E细胞；③高浓度亚组：64 nmol/L CHBP+10 μmol/L 顺铂处理NRK-52E 细胞。每组分别干预12 h、24 h。

1.2.2 细胞培养：NRK-52E 细胞常规复苏，用含10%小牛血清、1%青链霉素溶液的DMEM-F12 完全培养液于37 ℃、5% CO2温箱中培养，0.25%胰酶（含EDTA）消化并传代。NRK-52E 细胞以 5×105个/孔接种于6 孔板，每孔加完培至2.5 mL，培养24 h，此时NRK-52E 贴壁60%～70%，细胞形态良好。顺铂组加10 μmol/L 顺铂处理，干预组按照分组分别给予16、32、64 nmol/L CHBP 处理，再加 10 μmol/L 顺铂，分别诱导 12 h、24 h。

1.2.3 检测方法：采用Annexin V-FITC-PI 法检测各组细胞凋亡情况。每孔去上清后用0.5 mL 不含EDTA 的0.25%胰酶消化，显微镜下观察，待贴壁细胞脱落后每孔加入1 mL 完培终止消化。收集细胞，PBS 洗涤 2 次，加入 500 μL Binding Buffer 悬浮细胞，加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL Propidium Iodide，混匀。室温、避光，反应 15 min，上流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理 应用SPSS 24.0 统计学软件分析数据。计量资料以表示，组间差异性比较采用单因素方差分析、LSD 法及t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

对照组12 h 凋亡率与24 h 的差异无统计学意义（P＞0.05）；顺铂组 24 h 凋亡率较 12 h 增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在 12 h 和 24 h，顺铂组凋亡率高于对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；在12 h，低浓度亚组凋亡率与顺铂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），CHBP 干预中、高浓度亚组的凋亡率低于顺铂组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；在24 h，各浓度亚组凋亡率低于顺铂组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表1，图1。

表1 各组细胞凋亡率比较 %

3 讨 论

AKI 是指3 个月内肾脏结构或功能的异常，包括血、尿、组织检测或影像学肾损伤标志物异常。临床诊断标准为肾功能突然减退，48 h 内血肌酐（Scr）升高绝对值＞25 μmol/L（3 mg/L）或较基础值升高＞50%或尿量减少（＜0.5 mL/kg·h，超过 6 h）[3]。流行病学调查显示，AKI 发生率不断升高，病死率依然居高不下，尽管对AKI 的认识不断深入，支持或辅助治疗措施也有进展，但缺乏早期特异有效的治疗措施，预后仍恶劣。

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

国内外对AKI 病因研究，主要集中在缺血再灌注、脓毒症以及肾毒性。顺铂作为抗肿瘤一线药物，是患者发生药物性AKI 最常见的原因之一。顺铂肾损伤机制牵涉多因素的共同作用，可以通过对肾小管、肾血管的直接毒性作用，改变肾血流量和肾小球滤过率；可诱导肾间质炎症反应以及肾间质纤维化；也可通过各种细胞通路、细胞因子、信号分子传递引起肾脏的炎症、凋亡和坏死，从而直接损伤肾小管上皮细胞[4]。顺铂对肾脏的损伤作用具有剂量依赖性，如何最大程度减少其肾毒性而达到肿瘤最大治疗效应，成为目前研究的热点。有研究表明，抗氧化剂及许多巯基配体如Dendropanax morbifera、SRT1720、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、4-亚甲蓝基安息香酸、金属硫蛋白等对顺铂所致肾毒性具有一定保护作用[5-7]。

近年国内外报道EPO 具有显著的肾组织保护作用，对AKI 有较好的防治效果，但动物实验和临床研究显示，EPO 启动肾脏保护作用需高剂量，由此产生的高血压、血栓形成等诸多不良反应极大限制了EPO 的临床应用。找到EPO 组织保护作用的位点可特异性地避免其不良反应。研究发现，肾脏及其他器官中存在 β-共同受体（βcR，CD131），系 GMCSF、IL-3 和IL-5 受体共同亚单位，能与EPO 受体（EPOR）形成异源二聚受体，减轻炎性反应和抑制细胞凋亡，发挥组织保护作用，它有别于经典EPO 同源二聚受体，并不启动造血信号转导。Brines 等[8]应用蛋白构象技术的研究表明，EPO 由4 个螺旋结构（Helix A-D）连接成环，当EPO 与其同源二聚受体结合时，Helix B 的亲水表面并不与其接触。研究证实βcR 的配体为Helix B，进而在Helix B 螺旋亲水表面挑选出11 个氨基酸残基，人工合成线性多肽链（HBSP），即新型促红素衍生肽，达到促红细胞生成与组织保护作用分离的目的。HBSP 在动物模型中初步显示出良好的肾保护作用，而无促红细胞生成的副作用。我们前期研究也证实HBSP 通过抑制炎症反应以及细胞凋亡，达到对顺铂所致AKI 的肾脏保护作用。

本研究结果显示，肾小管上皮细胞经顺铂处理，随着作用时间的延长，肾小管上皮细胞早期凋亡率增加，间接证实顺铂对肾小管上皮细胞的毒性早期存在时间依赖性。采用CHBP 进行干预，12 h 内中、高浓度CHBP 对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有抑制作用，但低浓度CHBP 效果欠佳。24 h 后低、中、高浓度CHBP 均能有效抑制顺铂引起的肾小管上皮细胞凋亡，随着CHBP 浓度增加，肾小管上皮细胞凋亡率下降。

综上所述，本研究证实CHBP 可以通过抑制细胞凋亡，发挥对顺铂所致AKI 的保护作用，其效应与作用时间以及剂量呈正比。这为临床AKI 治疗提供新的思路，但如何应用于临床，仍需进一步深入研究。