扎冲十三味丸HPLC 指纹图谱建立及4 种成分测定

马瑞丽 李锦田 马桂芝

（新疆医科大学药学院， 新疆 乌鲁木齐830011）

扎冲十三味丸是新疆博尔塔拉蒙古自治州蒙医医院的院内制剂，由诃子、制草乌、石菖蒲、木香等13 味药材组成，功效祛风通窍、舒筋活血、镇静安神，用于半身不遂、左瘫右痪、口眼歪斜、四肢麻木、腰腿不利、言语不清、筋骨疼痛、神经麻痹［1-3］，对肩周炎气滞血瘀症也有确切的疗效［4］。

中药指纹图谱是采用现代分析检测技术，从中药物质基础角度出发，系统、整体、稳定地表征其共有成分及内在特征，在全面反映复杂体系的同时还能提供丰富的鉴别信息，能客观地从整体上评价中药复方制剂的质量［4-8］。扎冲十三味丸现行医院药品质量控制标准仅限于性状、鉴别、检查项，故本实验建立该制剂HPLC 指纹图谱，并测定其中没食子酸、鞣花酸、木香烃内酯、去氢木香内酯含有量，以期保证临床用药安全性和有效性，为其质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；New Classic MS 电子分析天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 艾柯超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 药物与试剂 没食子酸、鞣花酸、木香烃内酯对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为YA0505YA14、S02N7G24008、Z23M8S36648，纯度均≥98%）；去氢木香内酯对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-18101301，纯度99.20%）；扎冲十三味丸（新疆维吾尔自治区博尔塔拉州蒙医医院，批号分别为 20180820、20180917、20181018、20190219、20190326、20190418、20190515、20190611、20190719、20190812）；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 HPLC 指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -水（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A；10～70 min，10%～35%A；70～95 min，35% A；95～100 min，35%～33% A；100～105 min，33%A；105～115 min，33%～46%A；115～130 min，46%A；130～135 min，46%～42%A；135～160 min，42%A；160～170 min，42%～10%A）；体积流量1 mL／min；柱温40℃；检测波长225 nm；进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量，甲醇制成两者质量浓度分别为220、168 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取丸剂适量，研细，过40目筛，精密称取细粉1 g，置于25 mL 量瓶中，精密加入20 mL 甲醇，封口，超声处理30 min，放冷，甲醇定容至刻度，摇匀，静置，取上清液，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验 取同一批丸剂（批号20181018），按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，以12 号峰（木香烃内酯） 为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD＜0.3%，相对峰面积RSD＜3%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 重复性试验 取同一批丸剂（批号20181018） 6 份，按“2.1.3” 项下方法平行制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，以12 号峰（木香烃内酯） 为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD ＜0.4%，相对峰面积RSD＜3%，表明该方法重复性良好。

2.1.4.3 稳定性试验 取同一批丸剂（批号20181018），按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对保留时间RSD＜0.3%，相对峰面积RSD＜3%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.5 相似度评价 取10 批丸剂，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A 版） 进行峰匹配，得到指纹图谱（图1），中位数法生成对照图谱（图2），相似度（表1） 均大于0.980。HPLC 指纹图谱中有13个共有峰，通过与对照品色谱图保留时间及全波长紫外扫描图谱比对，确定12 号峰为木香烃内酯，13 号峰为去氢木香内酯。

表1 10 批样品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

2.2 4 种成分含有量测定

2.2.1 色谱条件 参考文献［9-14］。Agilent SBC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～10% A；10～14 min，10%～46% A；14～25 min，46%A；25～30 min，46%～70% A；30～45 min，70%A；45～50 min，70%～5% A）；体积流量1 mL／min；柱温30℃；检测波长225 nm；进样量10 μL，色谱图见图3。由此可知，各成分均与相邻色谱峰分离度良好，理论塔板数均大于5 000，阴性无干扰。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for ten batches of samples

图2 各成分对照图谱Fig.2 Reference chromatogram of various constituents

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、鞣花酸、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量，加甲醇制成四者质量浓度分别为164、83、34、40 μg／mL的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取丸剂适量，研细，过40目筛，精密称取细粉0.25 g，置于25 mL 量瓶中，精密加入20 mL甲醇，封口，超声处理30 min，放冷，甲醇定容至刻度，摇匀，静置，取上清液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液制备 按丸剂处方比例及工艺制备不含诃子、木香的阴性样品，精密称取0.25 g 至25 mL 量瓶中，精密加入20 mL 甲醇，封口，超声处理30 min，放冷，甲醇定容至刻度，摇匀，静置，取上清液，即得。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.2” 项下对照品溶液，依次倍量稀释，分别精密吸取10 μL，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归方程，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.5.2 精密度试验 取同一批丸剂（批号20181018），按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、鞣花酸、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面 积 RSD 分别为 0.63%、0.43%、0.76%、1.23%，表明仪器精密度良好。

2.2.5.3 稳定性试验 取同一批丸剂（批号20181018），按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，常温下于0、2、4、6、9、12 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、鞣花酸、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积RSD 分别为0.57%、0.62%、0.79%、0.28%，表明溶液在室温下12 h 内稳定性良好。

2.2.5.4 重复性试验 取同一批丸剂（批号20181018），按“2.2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、鞣花酸、木香烃内酯、去氢木香内酯含有量 RSD 分别为 1.76%、2.18%、1.51%、0.81%，表明该方法重复性良好。

2.2.5.5 加样回收率试验 精密称取6 份各成分含有量已知的丸剂细粉，加入各对照品溶液适量，按“2.2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.2.5.6 样品含有量测定 精密称取10 批丸剂细粉，每批0.25 g，按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，平行3 份，计算含有量，结果见表4。

3 讨论

3.1 指标成分选择 扎冲十三味丸中诃子具有涩肠止泻、敛肺止咳等功效，其中没食子酸、鞣花酸含有量较高［15-17］；木香具有行气止痛、健脾消食的作用，其中木香烃内酯、去氢木香内酯含有量较高［18-19］，故本实验以上述四者作为指标成分。该制剂作为经典蒙药成方制剂，疗效明确，相关研究［9，20-24］大多是在同一色谱条件下测定1～2 种成分含有量，或者在多种色谱条件下测定多种化学成分；本实验在前期研究的基础上建立了同一色谱条件下同时测定上述4 种成分含有量的HPLC 法，有助于全面控制其质量，节省时间和成本。

表4 各成分含有量测定结果（μg／g， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（μg／g， n＝3）

3.2 色谱条件选择 本实验采用二极管阵列检测器进行全波长扫描时发现，没食子酸、鞣花酸、木香烃内酯、去氢木香内酯均在225 nm 处有较好吸收，故选择其作为检测波长。考察乙腈-水梯度洗脱、甲醇-水等度洗脱、甲醇-0.1% 磷酸梯度洗脱对检测结果的影响，发现甲醇-0.1%磷酸梯度洗脱时极性相差较大的4 种成分均被检出，而且峰型、分离度、保留时间较理想。再考察了不同柱温（25、30、35℃），发现30℃下各成分与相邻峰分离度最高。

3.3 HPLC 指纹图谱分析 本实验采取“指纹图谱＋多指标成分含有量测定” 模式，对扎冲十三味丸进行质量评价，发现10 批样品相似度均大于0.98，4 种成分含有量比较接近，表明该制剂整体质量一致性较好。同时，该方法重复性好，准确度高，能较全面地反映扎冲十三味丸所含成分的种类及其内在品质，可用于其质量控制。