单针藻细胞超微结构及生物酶油脂萃取研究

刘 伟，林伟国，曾建立，荣峻峰

(中国石化石油化工科学研究院，北京 100083)

单针藻属于绿藻门单针藻属，细胞为不规则的纺锤形，宽4～8 μm，长12～26 μm。单针藻能够利用无机碳和废气中CO2进行光合作用自养生长，也可以有机碳为碳源异养及混养生长，而且有机碳为碳源时的生长明显优于无机碳源的自养生长[1]。单针藻生长速率快、油脂含量高，在氮、磷缺乏的条件下油脂含量超过50%[2]。油脂中C16和C18短链脂肪酸酯总量可达95%，其中C18单不饱和脂肪酸酯含量超过30%，是生物柴油生产的潜在原料之一[3]。单针藻可以用于污水和废气的处理，去除有毒酚类物质[4]。利用污水和废水培养单针藻，不仅能够净化污水及空气，还可以利用其中的营养物质，降低培养成本[5-6]。

将单针藻中的油脂有效、经济地萃取出来是发挥其潜力的关键技术之一[7]。微藻油脂的萃取通常是先对细胞破壁，然后采用物理压榨法、溶剂法或者超临界CO2法萃取[8-10]。酶解萃取法技术是采用对细胞组织及脂多糖、脂蛋白等复合体有降解作用的酶处理微藻，实现细胞破壁，并对脂蛋白、脂多糖分解，增加微藻中油脂在萃取剂中的流动性，促使油脂萃取出来。酶解法工艺条件温和，降解产物一般不会与萃取物发生反应，可以有效地保护油脂、蛋白质以及胶质等可利用成分的品质。在得到油的同时有利于回收微藻中的蛋白质及多糖等。酶解法操作能耗低，提取的油纯度高，磷脂含量、酸值及过氧化值低，色泽浅，废水中BOD与COD低，易于处理，污染少，符合“安全、高效、绿色”的要求[11-13]。

目前，用于单针藻油脂的萃取大多是Bligh-Dyer法[14-16]或其改进方法[17-18]，萃取前或萃取过程中通过超声波实现细胞破壁[19]。本课题利用酶解法对自制的单针藻细胞结构及油脂萃取进行研究。

1 实 验

1.1 原料及试剂

单针藻，中国石化石家庄炼化分公司微藻养殖示范基地养殖，藻种由中国科学院武汉植物园提供，培养基为BG11，碳源为炼油厂制氢尾气中的二氧化碳;醋酸、盐酸、甲醇、乙醇、氢氧化钠、氢氧化钾、三氯甲烷、正己烷，均为分析纯，由北京化工厂生产； 溶菌酶，20 000 IU/g，购于国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶，2 000 IU/g，果胶酶，20 000 IU/g，酸性蛋白酶，50 000 IU/g，购于北京鸿润宝顺科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

SG23 pH测定仪，由梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产；3-15 sigma离心机，由Sigma公司生产；SCT-06 Soxhlet提取器，由杭州汇尔仪器设备有限公司生产；JEM-1200EX透射电子显微镜，由日本电子公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 单针藻油脂理论含量单针藻油脂理论含量按Soxhlet萃取法[20]萃取结果计。取一定量单针藻在105 ℃下干燥2 h、研磨，在Soxhlet 萃取器中萃取至萃取剂无油迹为止。回收萃取剂，萃取瓶在105 ℃下干燥至恒重，萃取瓶增加的量计为单针藻油脂质量。萃取剂分别为正己烷和三氯甲烷甲醇混合液(体积比2∶1)。单针藻油脂理论含量(w)按式(1)计算。

w=W1W×100%

(1)

式中：W1为油脂质量，g；W为单针藻质量，g。

1.3.2 单针藻的超微结构单针藻冷冻切片，然后通过透射电镜观察其超微结构。透射电镜样品首先用体积分数为2.5%的戊二醛水溶液固定后离心，用0.2 mgL 的琼脂包埋，然后用质量分数为1%的锇酸水溶液固定，用磷酸缓冲液冲洗、系列乙醇丙酮水溶液脱水、Spurr树脂包埋、ReichertJung E超薄切片机切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后观察、拍照[21-23]。

1.3.3 酶解萃取油脂称取定量的单针藻干粉加入三口烧瓶中，加入适量水，搅拌均匀，水浴加热。按照200 IUg(藻)的量加入生物酶，50 ℃下酶解12 h。然后，加入计量的萃取剂常温下萃取1～3次，每次30 min。萃取液在离心机中于转速8 000 rmin下离心分离10 min。离心后置下层溶液到预先称重的烧杯中。待有机溶剂挥发后，把烧杯放入烘箱，60 ℃下干燥1.5 h。烧杯冷却后称量，按式(2)计算油脂收率(y)。

y=(m2-m1)m0×100%

(2)

式中：m0为单针藻样品质量，g；m1为烧杯质量，g；m2为含油脂烧杯质量，g。

单针藻油脂的萃取率(z)按式(3)计算。

z=yw×100%

(3)

1.3.4 单针藻油脂分析皂化物和不皂化物：按照国家标准GBT 5535.2—2008《动植物油脂 不皂化物测定 第2部分：己烷提取法》，先用KOH乙醇(95%)溶液皂化萃取的油脂，然后用正己烷萃取分离不皂化物。再通过盐酸滴定确定皂化物含量[24]，称量正己烷萃取物量，计算得到不皂化物量。

脂肪酸组成：先将油脂甲酯化，然后用正己烷萃取收集脂肪酸，经GC-MS分析确定其成分[15]。判断微藻油脂作为生物柴油原料的参数为不饱和度[25]，按式(4)计算。

DU=MU+2(PU)

(4)

式中：DU为脂肪酸不饱和度，%；MU为单不饱和脂肪酸质量分数，%；PU为多不饱和脂肪酸质量分数，%。

2 结果与讨论

2.1 单针藻油脂理论含量

Soxhlet法通常是在萃取剂沸点下回流，即萃取过程始终为新鲜纯净的冷凝液淋洗、浸泡，保证了浓度梯度最大，溶解扩散速率最快。加上时间较长，萃取更充分，油脂收率更高。Soxhlet法可以作为油脂萃取的基本方法，将其萃取得到的油脂含量当作微藻的理论油脂含量，与其他油脂萃取法的结果进行对比。正己烷和三氯甲烷甲醇混合液萃取单针藻的油脂理论含量分别为15.20%和30.04%，萃取时间为10 h。

2.2 单针藻细胞超微结构

单针藻是具有单层或多层细胞壁的浮游植物。单针藻的超微结构如图1所示。其中，图1(b)和图1(c)分别为单针藻的纵向剖面照片和横向剖面照片，图1(d)则显示单针藻处于分裂状态。从图1可以看出，单针藻呈椭圆形，边缘光滑，无鞭毛，具有明显的单细胞特征。横向剖面显示出多层细胞壁，细胞壁厚度约50 nm，细胞核处于细胞的前部，具有多个细胞器。纵向剖面显示，细胞器主要集中在细胞的一侧，另一侧多为类囊体和叶绿素。而细胞分裂时，边缘变的褶皱不平，存在更多的突起，表现为非等分分裂。

图1 单针藻细胞超微结构

通常藻类细胞壁包括内外层，其中外层是主要由纤维素、半纤维素、果胶质、藻酸盐、藻多糖和聚半乳糖硫酸酯等多层微纤丝组成的多孔结构，内层主要成分是纤维素和半纤维素。此外，细胞外壁还富含藻细胞释放的以多肽、多糖为主的胞外产物。

生物酶对细胞壁结构有特定的降解作用。表1为纤维素酶和复合酶(纤维素酶+果胶酶+蛋白酶+溶菌酶B)分别酶解单针藻后油脂萃取结果。从表1可以看出，纤维素酶酶解可以显著提高油脂收率，说明纤维素酶破坏了存在纤维素和半纤维素的单针藻的细胞壁。但加入含有其他生物酶的复合酶酶解后，油脂收率和纤维素酶酶解结果相差无几，说明单针藻细胞壁内外层主要由纤维素和半纤维素组成。

表1 生物酶对单针藻油脂萃取率的影响

注：萃取剂为三氯甲烷。

2.3 油脂萃取

微藻中的油脂是一种成分复杂的混合物，包括三酸甘油酯、二酸甘油酯、单酸甘油酯、类固醇等和游离脂肪酸、磷脂、鞘酯等。其中甘油酸酯和游离脂肪酸通过甲醇酯化可以形成脂肪酸甲酯，制备生物柴油。磷脂和类固醇等可以作为保健品和药品的原料，具有极高的价值。因此，除尽可能多地提取微藻中的甘油酸酯和游离脂肪酸之外，对微藻中的其他成分也应加以利用，产生更多的经济效益，降低微藻生产生物柴油的成本。

单针藻具有多层纤维素和半纤维素质的细胞壁。要将单针藻中的油脂从细胞中高效地分离出来，首先应该破坏细胞壁(破壁)，使得萃取剂易于进入细胞内部。考虑到能量消耗，破壁可以完全破坏也可以产生裂缝的部分破坏。但破壁越彻底，也越容易产生更多的细粉，给后续分离带来困难。其次，考虑萃取剂对油脂的溶解能力以及油脂表面环境影响，优化或强化萃取剂极性或非极性实现选择性的油脂萃取。再次，萃取油脂在萃取体系中的浓度梯度，浓度梯度越大，扩散速率越快，萃取效率也越高。

2.3.1 碱预处理对单针藻油脂萃取的影响在微藻液中，碱的加入可以调节体系的pH、改变藻细胞壁内外化学环境、软化或降解纤维素等。碱预处理条件为：用氢氧化钠调节pH到9，在80 ℃反应8 h，然后用醋酸调节pH到5。其对单针藻油脂萃取效果的影响见表2。从表2可以看出，碱预处理后，单针藻油脂收率可以提高10%以上。因此以下所有试验均经过碱预处理。

表2 碱处理对单针藻油脂萃取率的影响

注：溶剂为三氯甲烷。

2.3.2 助溶剂的影响依据“相似相容”的原理，微藻油脂的萃取效果与萃取剂的极性有很大关系。在油脂萃取剂中，正己烷、三氯甲烷和乙醇的极性依次增加。极性溶剂更有利于萃取极性油脂，非极性溶剂更利于非极性油脂的萃取。但细胞内部通常含有一定量的水分，附着在油脂表面、甚至包裹油脂。强极性的水会阻隔或者影响萃取剂的溶解。因此，在微藻油脂萃取的过程中，与水互溶性较差的有机溶剂作为萃取剂不利于微藻油脂的溶解。加入极性助溶剂有助于萃取剂与水相的有效浸润、接触和油脂萃取率的提高。助溶剂乙醇对单针藻油脂萃取效果的影响见表3。

表3 助溶剂对单针藻油脂萃取率的影响

注：纤维素酶酶解，双组分萃取剂体积比为1∶1。

从表3可以看出，正己烷的油脂收率较三氯甲烷更小，即正己烷萃取物中更偏重于极性更小的油脂。加入极性更强的助溶剂乙醇后，双组分的萃取剂体系对单针藻的油脂收率均有所提高。

2.3.3 萃取次数的影响微藻油脂萃取时，萃取剂首先穿过细胞壁扩散到油脂表面，溶解油脂，形成表面含油脂萃取液。然后含油脂萃取液经过细胞壁向萃取剂主体扩散，扩散速率取决于表面萃取液油脂浓度和主体萃取剂含油脂浓度差。萃取开始时，萃取剂主体油脂浓度为零，此时浓度差最大，扩散速率最快。随着萃取的进行，萃取剂主体油脂浓度增加，浓度差越来越小，扩散速率越来越慢，萃取效率也不断降低。增加萃取次数将提高油脂收率，即萃取一定时间后，过滤分离，分离后的微藻加入新鲜萃取剂在同样的条件下继续萃取，结果如图2所示。

图2 萃取次数对油脂收率和萃取率的影响溶剂为正己烷乙醇。■—油脂收率； ●—萃取率

从图2可以看出，随着萃取次数的增加，单针藻油脂收率和萃取率先快速增加，然后趋于平缓。萃取3次后，油脂萃取率即可超过80%。考虑到萃取剂的使用量、萃取时间等因素，萃取次数一般以不超过3次为宜。

2.4 单针藻油脂分析

2.4.1 皂化物和不皂化物表4为不同萃取剂萃取得到的油脂中皂化物和不皂化物含量。从表4可以看出，三氯甲烷萃取油脂收率较高，但油脂中皂化物含量则较低。说明极性更强的三氯甲烷萃取了更多的不皂化物。而以正己烷为萃取剂萃取的油脂含有更多的中性脂，皂化物含量更高，更适宜于生物柴油的制备。而不皂化物中含有高级脂肪醇、甾醇、色素及生育酚等高附加值成分，即极性更强的萃取剂萃取更有利于提高单针藻油脂的综合价值。

表4 不同溶剂萃取的微藻油脂收率及皂化物含量

2.4.2 油脂中脂肪酸成分脂肪酸的组成特别是碳链长度和不饱和脂肪酸含量对于能否适合制备生物柴油以及制备的生物柴油性质有重要影响。碳链越长、饱和脂肪酸含量越多，十六烷值越高。表5为单针藻油脂经过甲酯化后得到的脂肪酸的组成。

表5 单针藻油脂中的脂肪酸组成 w，%

从表5可以看出，单针藻油脂包含的脂肪酸种类较多，主要成分是棕榈酸(C16∶0)、棕榈油酸(C16∶1)、十八碳烯酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)及亚麻酸(C18∶3)等，其中C18∶1含量最高。因此，用于制备生物柴油，单针藻油脂会改善生物柴油低温流动性，有效降低多不饱和脂肪酸的易氧化性。同时，较高的C16∶0和C18∶1含量可降低不饱和度，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸质量分数之和达71.59%，不饱和度为97.20%，比较适于制备生物柴油。另外，单针藻油脂还含有一定量C20以上的长链脂肪酸，这些物质是普通动植物油脂不能提供的对人体健康有益的成分。

3 结 论

(1)单针藻具有明显的单细胞特征，细胞壁主要由纤维素和半纤维素组成，壁厚大约50 nm。

(2)纤维素酶酶解可以实现单针藻细胞的破壁。酶解法可以在较低的温度下萃取单针藻油脂，油脂收率大于13%，萃取率可达80%以上。

(3)单针藻油脂中脂肪酸主要由C16～C22组成，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸质量分数之和达71.59%，不饱和度为97.20%，显示单针藻油脂可以用于制备生物柴油。