紫外线诱变玫烟色棒束孢IF-1106菌株最佳条件的筛选

黄开云 任高雅 田晶

摘    要：为探究紫外线诱变玫烟色棒束孢IF-1106菌株的最佳条件，本研究以玫烟色棒束孢IF-1106菌株为对象、紫外线为诱变条件，通过单因素试验，分别选取3个较合适的孢子悬浮液浓度、紫外线诱变时间、紫外线诱变距离进行正交试验，并以菌落直径和产孢量为指标进行条件筛选。结果表明，不同的孢子悬浮液浓度、紫外线诱变时间、紫外线诱变距离均可对菌落直径及产孢量产生影响。其中在菌株的孢子悬浮液浓度为1.0×106 cfu·mL-1、处理时间为10 min、距离为30 cm的条件下试验结果最佳，在此诱变条件下，玫烟色棒束孢IF-1106菌株菌落直径为38.08 mm，产孢量1.26×107 cfu·mL-1。综合而言，最适紫外线诱变玫烟色棒束孢IF-1106菌株的孢子悬浮液浓度为1.0×106 cfu·mL-1、处理时间为10 min、距离为30 cm。

关键词：玫烟色棒束孢;紫外线诱变;菌落直径;產孢量;正交试验

中图分类号：Q968.1                文献标识码：A                DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.04.002

Abstract： In order to explore the best conditions of ultraviolet mutagenic Isaria fumosorosea IF-1106 strain， this study took the Isaria fumosorosea IF-1106 strain as the object， uv radiation as the mutagenic condition， through a single factor experiment， selected three more suitable spore suspension concentration， ultraviolet mutagenic time， ultraviolet mutagenic distance for orthogonal experiment . The optimum condition of IF-1106 strain induced by ultraviolet radiation was selected with the colony diameter and sporulation quantity as the indexes.  The experimental results showed that different spore suspension concentrations， UV mutagenic time and UV mutagenic distance could all affect the colony diameter and the sporulation quantity. Among them， the sporesuspension concentration of the strain was 1.0×106 cfu·mL-1， the treatment time was 10 min， the distance was 30 cm， the test results were best.In this condition ，the colony diameter was 38.08 mm， the production of 1.26×107 cfu·mL-1. In general， the most suitable UVmutagenic Isaria fumosorosea IF-1106 strain spore suspension concentration was 1.0 ×106 cfu·mL-1， treatment time was 10 min， distance was 30 cm.

Key words： Isaria fumodorosea; ultraviolet mutagenesis; colony diameter; sporulation; orthogonal experiment

玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）原称玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus）[1]，目前已被开发为微生物杀虫剂且为重要昆虫病原真菌，它可以寄生在多种昆虫及土壤中，一旦条件适宜，就可以进行繁殖产生孢子[2]。随着农业的发展，大量农药的使用使农业害虫产生了抗药性且数量骤增，导致农作物减产，造成经济损失。农业防治、生物防治等利用生态系统中各种生物之间相互依存、相互制约以达到减少有害生物的方法逐渐成为主流。玫烟色棒束孢的分布范围很广，其寄主范围也相当广泛，包括半翅目、双翅目、鞘翅目等[3]。玫烟色棒束孢不但可以防治害虫，而且可以防治植物病害和线虫。有研究发现玫烟色棒束孢可侵染烟粉虱所有虫态，且对其2龄若虫致病力最高，可作为防治该害虫的高效菌株[4]。近年来国内有关其生物学、分类、生化和应用的研究仍然较少[5]。

紫外线诱变是一种使微生物基因改变的物理诱变因素，它能使DNA上两个相邻的胸腺嘧啶相联结形成胸腺嘧啶二聚体， 从而使DNA的空间构象发生改变[6]。有研究表明，紫外线诱变能影响玫烟色棒束孢分生孢子的萌发率，适宜的紫外线照射可以提高玫烟色棒束孢的产孢能力，提高其对害虫的致病力（紫外线诱变10 min对农业害虫小菜蛾的致病能力最强，对其农业害虫的致死时间仅为1.97 d）[7]。因此，本研究将玫烟色棒束孢经过不同的紫外线照射时长、照射距离及不同的孢子浓度处理后，接种到PDA培养基上培养，通过测定菌落直径和产孢量以获得最佳紫外线诱变条件，为深入研究玫烟色棒束孢提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 玫烟色棒束孢IF-1106菌株，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心。使用时，取出活化[8]，然后接种到PDA培养基平板上[9]，置于25 ℃生化培养箱中培养，用于制作孢子悬浮液。

1.1.2 培养基 PDA培养基：去皮马铃薯400 g，葡萄糖40 g，琼脂34 g，蒸馏水2 L。

1.2 方法与步骤

1.2.1 孢子悬浮液的配置 在超净工作台中，将活化好的菌种接种于PDA培养基上进行扩大培养。用无菌刀轻轻刮取菌株，再用无菌水收集玫烟色棒束孢的分生孢子，用磁力搅拌器将分生孢子打散后，用四层无菌纱布过滤到小烧杯中再用血球计数板计数，计数之后调节孢子悬浮液浓度为1.0×107 cfu·mL-1[10]，用磁力搅拌器搅拌混合均匀备用[5]。

1.2.2 菌落直径和产孢量的测定 取培养后的菌落观察，用直尺测量直径并记录下来;测量完菌落直径之后，用灭菌后的打孔器在各培养基的菌落中心（滤纸片处）至边缘处打孔，每个菌落打5个孔，且5个菌饼的位置在各个培养基中基本保持一致。将5个菌饼置于5 mL无菌水中，用玻璃棒将其搅拌均匀，用两层灭过菌的纱布过滤后即为孢子悬浮液，用血球计数器计数母液的孢子浓度[11]，最终用公式计算其产孢量（本试验采用汤麦式血球计数器，其产孢量计算公式为：80个小方格孢子总数/80×4×106 cfu·mL-1。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验 （1）玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度的确定。在上一步的基础上将孢子悬浮液浓度稀释为5.0×106，1.0×106，5.0×105和1.0×105 cfu·mL-1，将5种浓度的悬浮液在紫外线照射时长10 min、距紫外线灯30 cm处的条件下处理后重新接种到PDA培养基上培养，培养好后测定菌落直径和产孢量。每个处理重复3次。

（2） 紫外线照射时间的确定。 在选取最适孢子液浓度及紫外线灯距离的条件下，设置5个不同紫外线照射时间：5，10，15，20和25 min，处理后重新接种到PDA培养基上培养，培养好后测定菌落直径和产孢量。每个处理重复3次。

（3）与紫外线灯照射距离的确定。在选取最适孢子液浓度及紫外线灯照射时间（时长）的条件下，设置五个不同紫外线照射距离：10，20，30，40和50 cm，处理后重新接种到PDA培养基上培养，培养好后测定菌落直径和产孢量。每个处理重复3次。

1.3.2 正交试验 在单因素的基础上进行正交试验，分别选取3个不同的玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度、3个紫外线照射时间、3个与紫外线灯的距离进行3因素3水平的正交试验。将测定的数据进行处理分析，得出结果。

1.4 数据处理

测量得到的数据用SPSS17.0（中文版）数据分析处理系统处理，计算均值及标准误差，选取3个较适合的浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度的确定 紫外诱变后玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度对菌落直径的影响如图1所示。从图中可以看出，不同浓度的孢子悬浮液经紫外诱变后对菌落直径有影响，部分浓度之间差异显著（P<0.05）。随着玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度的增大，菌落直径先增大后减小。菌落直径最大为38.2 mm，其次是36.6，36.5，29.1和18.7 mm。选取菌落直径较大的3个浓度（5.0×106，1.0×106和5.0×105 cfu·mL-1）作为正交试验因素的水平。

紫外诱变后玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度对产孢量的影响如图2所示。从图中可以看出，不同浓度的孢子悬浮液经紫外线诱变后对产孢量有一定影响，且相互之间存在差异，有些诱变距离之间差异显著（P<0.05）。随着玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度的增大，产孢量先增大后减小。产孢量最大为1.22×107 cfu·mL-1，其次是1.06×107，1.05×107 cfu·mL-1、0.79×107和0.75×107 cfu·mL-1。选取产孢量较大的3个浓度（5.0×106，1.0×106和5.0×105·mL-1）作为正交试验因素的水平。

2.1.2 紫外线诱变玫烟色棒束孢孢子悬浮液时间的确定     在1.0×106 cfu·mL-1玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度下，不同的紫外线诱变时长对菌落直径的影响如图3所示。从图3可以看出，在浓度不变的条件下，紫外线诱变时长对菌落直径有较大影响，诱变时长分别为10，15，20和25min时差异显著（P<0.05）。随着紫外线诱变时间的增大，菌落直径先增大后减小。菌落直径最大为36.0 mm，其次是34.8，34.7，32.0和28.3 mm。选取菌落直径较大的3个时间（5，10 和15 min）作为正交试验因素的水平。

在1.0×106 cfu·mL-1玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度下，不同的紫外线诱变时间对产孢量的影响如图4所示。从图中可以看出，在浓度不变的条件下，不同的紫外线诱变时间对产孢量的影响部分差异显著（P<0.05）。随着紫外线诱变时间的增大，产孢量先增大后减小。产孢量最大为1.04×107 cfu·mL-1，其次是0.83×107，0.80×107，0.54×107和0.32×107 cfu·mL-1。选取产孢量较大的3个时间（5，10和15 min）作为正交试验因素的水平。

2.1.3 紫外线诱变玫烟色棒束孢孢子悬浮液距离的确定 在1.0×106 cfu·mL-1玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度下，不同的紫外线诱变距离对菌落直径的影响如图5所示。从图中可以看出，在浓度不变的条件下，不同的紫外线诱变距离对菌落直径的影响不同，相互之间存在差异（P<0.05），也存在无明显差异距离。随着紫外线诱变距离的增大，菌落直径先增大后减小。菌落直径最大为37.6 mm，其次是35.2，35.1，30.8和29.3 mm。选取菌落直径较大的三个距离（20，30和40 cm）作为正交试验因素的水平。

在1.0×106 cfu·mL-1玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度下，不同的紫外线诱变距离对产孢量的影响如图6所示。从图中可以看出，在浓度不变的条件下，紫外线诱变距离对产孢量有影响，不同诱变距离之间有差异，且部分距离之间存在明显差异（P<0.05）。随着紫外线诱变距离的增大，产孢量先增大后减小。产孢量最大为1.17×107 cfu·mL-1，其次是1.05×107，1.01×107，0.64×107和0.61×107 cfu·mL-1。选取产孢量较大的3个距离（20，30和40 cm）作为正交试验因素的水平。

2.2 正交试验结果分析

由单因素试验结果得到了数据的选取范围，将玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度、紫外线诱变距离、紫外线诱变时间这3个因素各设置3个水平，进行正交试验。因素水平如表1所示。

正交试验所得数据综合分析结果如下表2和表3所示。

如表2所示，以菌落直径为指标，极差分析表明，试验设置3个因素对玫烟色棒束孢菌落直径的影响大小依次为：时间、距离、浓度，可见，时间对玫烟色棒束孢菌落直径的影响最大。最终得出的最优方案为：紫外线照射时间10 min，与紫外线灯距离30 cm，孢子悬浮液浓度1.0×106 cfu·mL-1。

如表3所示，以产孢量为指标，极差分析表明，试验设置3个因素对玫烟色棒束孢产孢量的影响大小依次为：时间、距离、浓度，可见时间对玫烟色棒束孢产孢量的影响最大。最终得出的最优方案为：紫外线照射时间10 min，与紫外线灯距离30 cm，孢子悬浮液浓度1.0×106 cfu·mL-1。为检测结果的可靠性，采用最优方案做验证试验，得到的菌落直径为38.08 mm，产孢量1.26×107 cfu·mL-1。

综上所述，最适合玫烟色棒束孢的紫外线诱变条件为：紫外线照射时间10 min，与紫外线灯距离30 cm，玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度1.0×106 cfu·mL-1。

3 结论与讨论

本试验以玫烟色棒束孢IF-1106菌株为研究对象，以培养基培养出来的菌落直径及产孢量为指标，分析得出最适合紫外线诱变玫烟色棒束孢的条件为：玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度为1.0×106 cfu·mL-1、紫外线照射时间为10 min、紫外线照射距离为30 cm。在此条件下得到的菌落直径为38.08 mm，产孢量1.26×107 cfu·mL-1。

大多数致病真菌可以对类酮物质进行糖化[12]，侵染昆虫后，通过次生代谢物质引发昆虫病变而死亡。最新研究表明，該代谢物质不仅可以杀虫，还具有促进植物生长的生理功能[13]，因此玫烟色棒束孢在生物防治和农业生产方面表现出巨大潜力[14]。

该试验发现，玫烟色棒束孢菌落直径和产孢量均随紫外线照射时长梯度和距离梯度的变化呈现出先增大后减小的趋势。且有人研究环境因素对该菌的影响得出的结论为：随着紫外线照射时长的增加，孢子萌发率明显下降[15]。因此推断出玫烟色棒束孢IF-1106菌株对紫外线照射时长及距离具有一定的耐受限度。同时随着紫外线诱变方法研究的深入，很多科研工作者为寻求进一步的突破曾尝试过对孢子原生质体直接进行诱变，其效果并不明显优于对孢子悬浮液进行诱变[16]。

玫烟色棒束孢的相关试验虽然日益增多，但由于其实践应用效果不够稳定，直接投入农业生产还存在许多问题，应基于理论基础加大该菌实践应用方面研究的力度。

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