超高效液相色谱-串联质谱法快速测定豆芽中6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2,4-滴和赤霉素

李娜 卢娜 邵辉 刘磊 李辉 张玉婷 郭永泽

摘    要：本研究建立了豆芽中6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2，4-滴和赤霉素4种植物生长调节剂残留量的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品中残留的药物经甲酸乙腈提取，提取液浓缩、甲醇定容后，采用电喷雾串联质谱仪在正、负离子多反应监测扫描（MRM）模式下进行测定，基质外标法定量。4种药物在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数均为0.999。对黄豆芽和绿豆芽中6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2，4-滴和赤霉素在定量限（LOQ）、5倍LOQ和10倍LOQ 3个添加浓度水平下的回收率进行测定，其平均回收率为81.6% ～94.4%，相对标准偏差为2.4%～6.9%。6-苄基腺嘌呤、2，4-滴、4-氯苯氧乙酸钠和赤霉素的定量限（S/N≥10）分别为0.005，0.02，0.05和0.05 mg·kg-1。该方法操作简便，净化效果好，灵敏度、准确度和精密度均符合多残留分析的要求，可为豆芽中非法添加物的残留监控提供技术支持。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法;豆芽;植物生长调节剂;残留

中图分类号：TS255.7         文献标识码：A            DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.04.001

Abstract：  An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was developed for the determination of residues of four kinds of plant growth regulators in bean sprout. The target compounds were 6-benzylam inopurine， 4-chlorphenoxyacetic sodium， 2， 4-D and gibberellic acid. The analytes were extracted with acetonitrile containing 1% formic acid solution， and evaporated to remove acetonitrile， then dissolved by methanol， finally detected by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring （MRM） mode via positive and negative electrospray ionization. The results showed that the correlation coefficients of the calibration curves for the four compouds were 0.999 in the range of LOQ ～ 20LOQ. The method was validated at three fortification levels （LOQ， 5LOQ and 10LOQ） in soybean sprout and mung bean sprout. The respective mean recoveries were found to be between 81.6% and 94.4%， and the relative standard deviations （RSD） were between 2.4% and 6.9%. The limits of quantification （S/N≥10） of 6-benzylam inopurine， 2， 4-D， 4-chlorphenoxyacetic sodium and gibberellic acid were 0.005， 0.02， 0.05 and 0.05 mg·kg-1 respectively. It was indicated that the method developed in this study was easy， sensitive and good purified. The sensitivity， accuracy and precision of the method were all acceptable. The method can meet the requirements of the multiple residue analysis and can be further applied to investigate the illegitimate additive residues status in bean sprout.

Key words： ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; bean sprout; plant growth regulator; residue

近年來，全国多地曝出“毒豆芽事件”，即在豆芽生产过程中使用6-苄基腺嘌呤（6-BA）、4-氯苯氧乙酸钠（4-CPA）、2，4-滴（2，4-二氯苯氧乙酸，2，4-D）和赤霉素（GA）等植物生长调节剂促进豆芽快速生长，达到只发芽不生根目的，因此又称无根豆芽素、豆芽激素。目前，豆芽生产中使用上述物质的安全性尚无定论，但是如果食用过量，肯定会给人的身体健康带来危害。

我国GB 2760-1996《食品添加剂使用卫生标准》曾允许6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠用于豆芽生产，后又在新版国标GB 2760-2011中撤销。农业部2015年第11号公告《关于豆芽生产过程中禁止使用6-苄基腺嘌呤等物质的公告》，明确规定不得生产和销售含有6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、赤霉素等物质的豆芽，否则将依照法律法规予以处理。

目前，豆芽激素的检测方法有液相色谱法[1-5]、气相色谱法[1]、液相色谱-串联质谱法[2，6-15]等，但是已有检测方法普遍存在单组分测定、前处理步骤繁琐，不同组分采用不同的前处理方法、存在检测周期长、耗时耗力等缺陷，已不能满足检测机构的要求。因此，亟需建立通过一种多残留检测方法，能够同时测定豆芽中多种植物生长调节剂的方法。

本研究建立了同时测定豆芽中6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2，4-滴和赤霉素4种植物生长调节剂残留量的超高效液相色谱-串联质谱方法，操作简便、快速，节约成本，可为各食品检测机构对豆芽中非法添加物的监控提供更加便捷的检测，对保障豆芽的质量安全具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

AcquityTM UPLC超高效液相色谱仪，Quattro Premier XE三重四极杆质谱仪（配电喷雾离子源），（美国Waters 公司）;旋涡混合器（QL-901，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）;台式高速离心机（H1650，湘仪离心机仪器有限公司）;旋转蒸发仪（Laborota 4000 efficient，德国Heidolph）; Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）等。

6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2，4-滴和赤霉素标准品，纯度均不低于99%，购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇为色谱纯，购自美国Fisher公司;水为超纯水;甲酸为分析纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司。

分别称取各标准品适量，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，于4 ℃温度条件下保存，有效期3个月。分别吸取4种农药标准储备液1.25 mL于25 mL容量瓶，用甲醇稀释并定容，配制成浓度为10 μg·mL-1的混合标准工作液，于4 ℃条件下保存，有效期1个月。

1.2 样品前处理方法

准确称取捣碎的试样5.00 g（精确至0.01 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL乙腈，于旋涡混合器上涡旋2 min，加入0.4 mL甲酸，再涡旋2 min，4 000 r·min-1离心5 min，上清液转移至100 mL梨形瓶中，于40 ℃条件下旋转蒸发至约2.5 mL，用甲醇定容至5 mL，过0.22 μm有机滤膜，供液相色谱-串联质谱仪分析。

1.3 色谱条件

色谱柱：AcquityTM BEH C18柱 （2.1×50 mm，1.7 μm）;流动相：乙腈（A相）-0.1%甲酸水溶液（B相）;梯度洗脱条件见表1。进样量：10 μL;柱温：30 ℃。

1.4 质谱条件

电离模式：电喷雾正离子ESI（+）和负离子ESI（-）切换;毛细管电压：3.0 kv;离子源温度：110 ℃;脱溶剂气温度：380 ℃;脱溶剂气流量：550 L·h-1;锥孔反吹气流量：50 L·h-1;多反应监测扫描方式（MRM）;质谱采集参数见表2。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件    在电喷雾正离子或负离子模式下分别对1 μg·mL-1的单个标准溶液进行全扫描，得到每种化合物的母离子，再进行母离子二级质谱全扫描，选择信号强度较大的两个碎片离子为特征离子，并优化最佳锥孔电压和碰撞能量，最后以多反应监测方式扫描。最优的质谱参数见表2。

2.1.2 液相色谱条件  本研究选择通用的Acquity BEH C18柱（2.1×50 mm， 1.7 μm），分别以乙腈和甲醇作为流动相，结果表明，相同条件下乙腈的洗脱能力更强，色谱峰形和响应更好。分别以水、0.1%甲酸和0.1%甲酸（含5 mmol·L-1乙酸铵）为流动相水相，结果表明，0.1%甲酸效果最好，加乙酸铵后负离子的响应并未提高，反而降低。因此，本研究以乙腈-0.1%甲酸为流动相。

采用梯度洗脱，研究4种化合物的最佳分离条件。经过反复试验，确定最佳的梯度洗脱条件：在0.2 mL·min-1的流速下，0～3 min，乙腈从10%匀速变化至90%;3～4 min，乙腈保持90%，4～5 min，乙腈保持10%，如表1所示。4种化合物能够完全分离，且峰形良好，整个分析过程在5 min之内即可完成。LOQ浓度水平豆芽加标样品中4种化合物的总离子流图和MRM色谱图见图1和圖2。

2.2 定容溶液的选择

本研究比较了乙腈、甲醇及不同比例的甲醇-水混合溶液作为定容溶液的溶解效果。结果表明，6-苄基腺嘌呤用甲醇溶解比乙腈效果好，其他3种化合物无明显差别。此后又比较（10+90）、（20+80）、（50+50）等不同体积比的甲醇-水溶液的溶解效果，结果表明，当甲醇-水的体积比为（50+50）时，溶解效果最好。因此，确定甲醇-水（50+50， v/v）为定容溶液。

2.3 样品前处理条件的优化

文献报道的提取溶剂有酸化乙腈[1，10-15]、酸化甲醇[1-2]、丙酮[1]、稀碱（0.01mol·L-1氢氧化钠溶液）[1-2，4]、甲醇[3，5]和乙腈[6-7]，净化方法有MCS柱[10]、HLB柱[13]固相萃取净化法和QuEChERS方法[11-12，14-15]。

本研究尝试采用乙腈提取，但酸性化合物4-氯苯氧乙酸钠、2，4-滴和赤霉素回收率较低;用1%甲酸乙腈提取，3种酸性化合物回收率提高，但6-苄基腺嘌呤回收率降低。最终本研究采用乙腈和1%甲酸乙腈各提取1次，获得了满意的回收率，同时减少了有机溶剂用量。

此外，本研究采用提取液浓缩、定容后直接进样分析的前处理方法，通过增大定容体积、稀释样品基质从而达到降低基质干扰的目的，无需固相萃取等步骤，既操作简便，又节约成本，为各食品检测机构提供了快速、便捷的检测方法。

2.4 方法的线性、灵敏度、准确度和精密度

为了消除基质效应，本试验用基质匹配标准工作溶液绘制标准曲线。以各组分的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性方程和相关系数见表3。结果表明，4种化合物在各自的浓度范围内，线性关系良好，相关系数均为0.999。以信噪比大于3计算方法的检出限，以信噪比≥10确定方法的定量限，6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2，4-滴和赤霉素的定量限分别为0.005，0.05，0.02和0.05 mg·kg-1。在LOQ、5LOQ和10LOQ 3个浓度水平做加标回收试验，每个浓度水平做5个平行样品，按照上述方法进行前处理和测定。在3个加标浓度水平，4种化合物在黄豆芽和绿豆芽中的平均回收率和相对标准偏差 （RSD） 均列于表3中。4种化合物的平均回收率为81.6% ～94.4%，相对标准偏差为2.4% ～6.9% ，符合多残留分析的要求。

3 讨论与结论

本研究分别对液相色谱和质谱仪器条件、定容溶液的种类和不同配比、样品处理条件进行了筛选和优化，建立了同时测定豆芽中6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2，4-滴和赤霉素4种非法添加物残留的超高效液相色谱-串联质谱方法，采用基质外标法定量，可有效消除基质效应。

跟现有检测方法相比，省去了QuEChERS或SPE柱净化操作，采用乙腈和酸化乙腈各提取1次，提取液只经过一步旋蒸，最后用甲醇稀释并定容，解决了酸性化合物4-氯苯氧乙酸钠和2，4-滴提取回收率较低的难题，同时简化了前处理步骤，提高了检测效率，节约了检测成本。该方法操作简便，净化效果好，灵敏度、准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求，可为食品检测机构对豆芽激素的日常监控提供更加便捷的检测技术支持。

参考文献：

[1]安徽省质量技术监督局. DB34/T 2821-2017 豆芽中植物生长促进剂残留量测定 液相色谱——串联质谱法[S].出版地不详：出版者不详， 2017.

[2]浙江省质量技术监督局. DB33/T 625.3-2007（2016）？无公害豆芽 第三部分：6-苄基腺嘌呤残留量和4-氯苯氧乙酸钠残留量的测定[S].出版地不详：出版者不详，2016.

[3]林琳.豆芽中6-苄基腺嘌呤的测定方法研究[J].食品工业， 2008（3）：65-67.

[4]李小平，蒋经伟，范建中，等.固相萃取HPLC法测定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠[J].中国卫生检验杂志， 2006， 16（3）：267-269.

[5]柴勇，杨俊英，李必全，等.市售豆芽中激素和生长调节剂检测分析[J]. 西南农业学报，2007， 20（4）：698-701.

[6]中华人民共和国农业农村部. GB 23200.21-2016 食品安全国家标准 水果中赤霉酸残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法[S]. 北京：中国标准出版社， 2017.

[7]谢寒冰，林洪，蒋万枫，等.高效液相色谱——电喷雾质谱联用法检测豆芽中残留的6-苄基腺嘌呤[J].山东农业科学， 2008（2）：92-94.

[8]李健，郑磊.液相色谱——串联质谱测定豆芽中4中植物生长调节剂[J].现代食品科技， 2019， 35（1）：257-263.

[9]朱群英，朱玉玲，索莉莉，等.在线固相萃取——高效液相色谱法同时测定豆芽中11种植物生长剂和杀菌剂[J]. 分析科学学报， 2018， 34（4）：507-512.

[10]刘柏林，谢继安，赵紫微，等.稳定同位素内标/超高压液相色谱——串联质谱法同时测定水果与豆芽中10种植物生长调节剂残留[J].分析测试学报， 2017， 36（5）：601-606.

[11]謝寒冰，周明莹，赵海峰，等.高效液相色谱——四极杆飞行时间质谱法同时检测豆芽中的3种外源植物激素残留[J].色谱， 2014， 32（5）：493-498.

[12]张亚莲，柳菡，王岁楼，等.高效液相色谱——串联质谱法测定豆芽中8种药物残留[J].分析测试学报， 2015， 34（2）：164-170.

[13]叶佳明，王京，钟世欢，等.高效液相色谱——串联质谱法测定豆芽中6种植物生长调节剂的残留[J].农产品加工， 2018（2）：39-42.

[14]吴平谷，谭莹，张晶，等.分级净化结合气相色谱——质谱联用法测定豆芽中10种植物生长调节剂[J].分析化学， 2014， 42（6）：866-871.

[15]廖浩，蒋湘，苏海雁，等.超高效液相色谱——四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定豆芽中的11种植物生长调节剂[J].食品科技， 2019， 44（2）：333-338.