一株黑枸杞内生真菌红色素提取工艺及其稳定性分析

韦冠宇，杨小朵，李松澄，郑敬晖，蓝秋菊，刘俊林*

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730110）

色素在日常生活和科研等领域都有重要的应用，由于合成色素的问题越来越来受到人们的关注，因此安全性高、具有一定药用价值天然色素日益受到人们的认可[1-2]。

微生物色素作为天然色素不受限制，与其他色素具有不可比拟的优越性[3]。天然色素一般稳定性较差，对温度、pH、氧化剂、添加剂、金属离子、添加剂等因素非常敏感，其稳定性会随着环境条件的变化而发生改变[4]，色素的稳定性在一定程度上决定了其应用范围，由此可知色素稳定性的研究具有非常重要的意义。本文以一株产红色素枸黑枸杞内生真菌G根7为对研究对象并产生红色素的稳定性进行一系列探究，为该色素进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 产红色素菌株

内生真菌G根7，由西北民族大学生命科学与工程学院生物工程实验室从黑枸杞植株根部分离获得纯化后加入无菌甘油后置于-80℃条件下保存。

1.1.2 试剂

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基,北京索莱宝（Solar-bio）科技有限公司;葡萄糖、琼脂粉、无水乙醇、乙酸乙酯等试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

Nano-drop 1000-UV型分光光度计，日本岛津公司；MaxQ436大型落地式恒温摇床，美国Thermofish ；HWS型智能恒温恒湿箱，宁波东南仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色素的提取

将保存的菌株用接菌环挑取菌丝接于PDA平板培养基活化，待培养基中色素含量饱和后，将菌丝与培养基分离，弃菌丝留含色素的培养基，将其培养基破碎后浸泡在蒸馏水中，料液比为质量：体积＝1：10，1500r/min置于摇床振荡24h[1]，过滤取上层色素清液，浓缩至30～50ml,真空干燥得粗色素提取物，去离子水稀释至1mg/mL备用。

1.2.2 色素吸收光谱曲线的测定

取上述1mg/mL红色素提取液5mL置于比色皿中，以蒸馏水作为对照组，用Nano-drop 1000-UV型分光光度计在波长为320～580nm间进行吸光值测定，以10nm为间隔进行扫描记录数据，重复测量3次取其平均值绘制光谱曲线，观察光谱特征，分析确定其最大吸收峰值。

1.2.3 温度对色素稳定性影响

取50mL浓度为1mg/mL色素溶液置于100mL锥形瓶中，分别于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃恒温水浴条件下、保温1h[6]，将其迅速冷却至常温观察颜色变化，以蒸馏水为对照分别测定各条件下最大吸收波长处的吸光值，重复3次实验取其平均值，分析其在20～100℃温度范围内的稳定性。

1.2.4 p H对色素稳定性影响

取5mL浓度为1mg/mL色素溶液，色素溶液与酸碱试剂以3︰1的比例，对照组色素溶液与蒸馏水以3︰1的比例，分别与pH=2、pH=4、pH=6、pH=8、pH=10、pH=12的酸碱试剂分混匀静置1h后，于分光光度计下分别测定其在最大吸收波长处的吸光值，重复测量3次取其平均值, 分析不同pH值对色素稳定性。

1.2.5 不同浓度氧化剂对色素稳定性影响

取5mL浓度为1mg/mL色素提取溶液，分别加入3mL浓度为 0mg/mL、0.2 mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0 mg/mL的氧化剂H2O2、Na2SO3溶液，对照组色素溶液加入蒸馏水3mL混合均匀后，观察溶液颜色变化并于分光光度计下测定其最大吸光值，重复测量3次取其平均值，分析比较其在各氧化剂溶液中的稳定性。

1.2.6 金属离子对色素的稳定性影响

取5mL浓度为1mg/mL色素提取溶液，分别加入含有3mL浓 度 为 0.5mg/mL 含 有 Ca2+、K+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Pb2+的金属离子水溶液（溶液中只含一种金属离子），对照组色素溶液加入蒸馏水3mL混合均匀后,室温下静置1h后观察溶液颜色变化，并于分光光度计下测定其最大吸光值，重复3次实验取其平均值。分析比较其在各金属离子溶液中的稳定性。

1.2.7 不同添加剂对色素的影响

取5mL浓度为1mg/mL色素提取溶液，分别加入含有3mL浓度为0.5mg/mL含有山梨醇、淀粉、酒石酸钾钠、柠檬酸、葡萄糖、蔗糖、乳糖的水溶液，对照组色素溶液加入蒸馏水3mL混合均匀后,室温下静置1h后观察溶液颜色变化，并于分光光度计下测定其最大吸光值，重复3次实验取其平均值，分析比较其在不同添加剂溶液中的稳定性。

2 结果与分析

2.1 产红色素内生真菌G根7菌株及色素提取液

图 1 菌株正面

图 2 菌株背面

图 3 色素提取液

2.2 色素特征吸收光谱曲线

图4 为红色素在320～580nm(每隔10nm测量一次)范围内用可见分光光度计测试形成的图谱。图可知该色素在可见光范围内有2个吸收峰，最大吸收峰为390nm其对应的最大吸光度值为1.04。

图4色素特征吸收光谱曲线

2.3 温度对色素稳定性影响结果

图5 所示，该色素在20～100℃温度范围内能存在,在该温度范围内处理后，观察颜色无太大变化，再将其置于可见分光光度计下测定其吸光值，发现在温度在达到60℃之后，该色素的吸光值有较为明显的下降，证明该色素不耐高温。

图5 温度对色素稳定性影响

2.4 pH对色素稳定性影响

如图6所示，该色素在pH=2～12范围内能稳定存在,在pH=2～12 范围内作用后发现颜色无明显变化，将其放置于可见分光光度计下测定其吸光值，测量结果发现在pH=4～8时，色素出现较为明显的增色效应，且无明显的化学反应发生。说明该红色素在一定酸碱条件下能稳定存在，便于实际生活中应用，由测量结果可知该色素在酸性条件下的增色作用强于碱性条件。

图6 不同pH值对色素稳定性影响

2.5 不同浓度氧化剂对色素稳定性影响

由图7显示氧化剂对该红色素的影响比较大，不同浓度的氧化剂的该红色素的作用不同，结果表明0.8mg/mLNa2SO3溶液对该色素色泽有明显的增强作用，并且Na2SO3溶液的护色作用强于 H2O2溶液。

图7 不同浓度氧化剂对色素稳定性影响

2.6 金属离子对色素的稳定性影响

由 图 7 可 知 该 红 色 素 在 Ca2+、K+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Pb2+的金属离子水溶液中能稳定存在，但各离子对色素的作用效果不尽相同。通过实验结果表明：Fe2+和Al3+对该色素有明显的护色作用。

图8 金属离子对色素的稳定性影响

2.7 不同添加剂对色素的影响

由图8可只在实验中所加人的不同添加剂中，淀粉对该红色素的的护色有明显的增强作用，在波长390nm的条件下测得的吸光值为1.435，是其他添加剂的3.5倍。猜想该色素有良好的染色作用，可用于一些纺织品的染色。

图9 不同添加剂对色素的影响

3 结论与展望

本研究在黑枸杞根部中分离出一株产红色素的内生真菌G根7，通过PDA培养基培养发现其能产生红色素，且该色素为水溶性色素，便于提取分离。实验结果显示该色素在20℃～100℃的条件下稳定存在，在一定范围内不必担心因温度问题而造成色素品质下降。在p H=4～8时，色素出现较为明显的增色效应，且无明显的化学反应发生。在生产实践中可适量加入亚硫酸钠以提高色素品质，使颜色更鲜艳。金属离子Fe2+、Al3+对该色素都有明显增色作用，在非食品实际生产中可适量加入其中之一[5]，提高产品色泽。本文所提取的红色素是药用植物枸杞内生真菌的次生代谢产物，其与枸杞长期共生可能产生与之具有相同或相似作用的活性物质[6]，笔者猜想可用于抗氧化、抗衰老、抗菌等方面的保健品或药品的研究。但该色素在纯化处理、理化性质、基本结构，食用安全上还有待进一步的深入研究，以期为化妆品、食品行业等做出一定的贡献[7]。