苯甲醇在石粉牙膏防腐体系中的应用研究
2020-07-07黄柳云梁莹莹李江平黄晓燕韦玉金
黄柳云 梁莹莹 李江平 黄晓燕 韦玉金 许 逊
(柳州两面针股份有限公司 545001)
牙膏是人们日常生活的必需品，牙膏的品质直接影响消费者的使用感受和健康。牙膏在生产、使用过程及保质期等各环节中，会因使用原料、生产环境等诸多因素的影响，而受到微生物的污染。当微生物达到一定数量后，易出现产品的变色、变味及分离出水等质量问题[1]。为了牙膏质量的稳定和消费者使用的安全，牙膏中有必要加入一定量的防腐剂。
在我国2015版《化妆品安全技术规范》中，被允许使用的防腐剂类型有51种。综合考虑到抑菌效果、安全性以及价格，目前在牙膏防腐体系中常用的防腐剂有苯甲酸钠、苯甲醇、尼泊金复合酯钠等。在pH值较高的体系中，苯甲酸钠的抑菌效果会明显下降，石粉体系牙膏的pH值一般都较高，在该体系中使用苯甲酸钠作为防腐剂效果不好[2]，故本实验选用以苯甲醇主，尼泊金为辅的防腐体系，通过LB肉汤抑菌实验，测试不同浓度的苯甲醇在单独使用及与尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠复配后，对环境腐败阳性细菌的抑菌能力，选择具有良好效果的防腐剂样例与牙膏基础配方进行牙膏样品配制，进行微生物挑战性实验，以验证苯甲醇的防腐效果，为石粉牙膏的防腐体系研究提供参考依据。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
原料：苯甲醇(由湖北绿色家园提供)、尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠(由江南大学提供)。
菌种：大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、铜绿假单胞菌(ATCC9027)、白色念珠菌(ATCC10231)、黑曲霉(ATCC16404)、平滑正青霉(ATCC10464)，标准菌种由广东省微生物分析检测中心提供。
从生产环境用水、原料以及变质样品中分离并鉴定的菌株：泛菌属(Pantoea Gavini et al.,1989)JS079-123G、盐单胞菌(Halotalea alkalilenta)JS079-123E、类芽孢杆菌属(Paenibacillus cineris)FX4、枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis)FX14，由广东省微生物分析检测中心鉴定。
试剂：磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH值为7.2～7.4)；0.85%生理盐水；卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基、营养琼脂培养基、LB肉汤培养基、TTC指示剂，均由广州环凯微生物科技有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1菌种制备
取细菌第3～6代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18～24h)，用30ml0.03mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗下菌苔，制成菌悬液。大肠杆菌在450nm波长处吸光度(Optical Density，OD)为1.5～1.7的菌悬液；金黄色葡萄球菌在450nm波长处吸光度(Optical Density，OD)为1.4～1.6的菌悬液，用细菌计数板测定细菌的浓度为109cfu/ml，备用。将黑曲霉和绳状青霉从甘油管中分别接种到PDA平板，置于恒温培养箱中28℃培养7d。培养好后用灭菌缓冲液PBS洗脱孢子，并稀释至106cfu/ml，血球计数板计数，备用。
其中泛菌属、盐单胞菌制成109cfu/ml的环境腐败阴性混合菌悬液，类芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌制成109cfu/ml的环境腐败阳性混合菌悬液，备用。
1.2.2LB肉汤抑菌实验
制备100mL/瓶LB肉汤培养基于锥形瓶中，灭菌备用。以无菌操作将防腐剂按照作用浓度按比例加入100m的LB肉汤培养基中，制成抑菌溶液。取1ml含菌量为108cfu/ml的菌悬液接种于抑菌溶液中，作为试验组样本；以同样的方法将菌悬液接种不含防腐剂的LB肉汤中，作为阳性对照组样本；取1瓶空白LB肉汤培养基作为阴性对照组样本。将试验组样本、阳性对照组样本、阴性对照组样本放置在37℃的摇床中振荡培养48h，然后分别吸取振荡后液各1mL，以琼脂倾注法接种平皿，每个样液接种两个平皿，置于37℃培养48h，用平板计数法进行活菌计数。
1.2.3微生物挑战性实验
本次实验参考化妆品、盥洗用品与香料协会(CTFA)、美国药典的微生物挑战性实验方法[3,4,5]以及实际生产情况，即将霉菌混合后制成106cfu/g的菌膏，细菌混合后制成107cfu/g的菌膏，分别取10g菌膏接种到90g牙膏样品中，在第7d、14d、21d和28d用平板计数法检测微生物的存活状态。
1.3 样品配置
1.3.1LB肉汤实验样品
表1 LB肉汤抑菌实验样品配比表 单位：%
原料分组1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#山梨醇28282828282828282828苯甲醇0.50.40.30.20.10.30.30.20.20.5尼泊金丙酯钠-----0.1-0.1-0.1尼泊金丁酯钠------0.1-0.10.1
1.3.2微生物挑战性实验样品
依据LB肉汤实验结果，选择具有抑菌效果的防腐剂样例与牙膏基础配方进行牙膏样品配制，进行微生物挑战性实验。
2 结果与分析
2.1 LB肉汤抑菌实验结果
LB肉汤抑菌实验主要根据实际生产环境中产生的腐败生物，进行防腐剂配比的初筛实验。根据细菌在液体中通过快速长时间振荡，快速增加微生物的数量以及增加微生物与防腐剂的接触，以显示其抑菌作用。试验根据平皿菌落计数判定其是否具有抑菌能力。LB肉汤抑菌实验结果见表2。
表2 LB肉汤抑菌实验结果
由表2可见:①随着苯甲醇浓度的增加，测试样品对环境腐败菌的抑菌效果逐渐增强；②苯甲醇与尼泊金丙酯钠复配的抑菌效果，要优于苯甲醇与尼泊金丁酯钠复配的抑菌效果；③0.5%苯甲醇的抑菌效果与0.3%苯甲醇+0.1尼泊金丙酯钠的抑菌效果相同。
2.2 挑战性试验结果
根据2.1中LB肉汤抑菌实验结果，选择1#、2#、3#、6#、10#五个防腐剂配比，复配碳酸钙、山梨醇、K12、黄原胶以及洁净水等原料进行牙膏样品配制。
判定标准：当细菌在7d时下降到100cfu/g以下，7～28d全部为0，并且测试期间没有增加，则视为效果优良通过挑战试验；若7d时下降到1000cfu/g以下，在7～28d内菌数持续下降，并保持在100cfu/g以下，则视为通过；若7d时下降到1000cfu/g以上，在7～28d内菌数持续下降，保持在100cfu/g以下，则视为勉强通过；若7d时下降到1000cfu/g以上，且在7～28d内菌数无下降趋势，则视为不通过。
霉菌在7d时下降到1000cfu/g以下，并且测试剩余的在合适的数据范围内没有增加，则视为通过。
对标准细菌的挑战性实验结果见表3。
表3 标准细菌的挑战性实验结果
对标准霉菌的挑战性实验结果见表4。
表4 标准霉菌的挑战性实验结果
对环境腐败细菌的挑战性实验结果见表5。
表5 环境腐败细菌的挑战性实验结果
由表3、4、5可知：
①样品10#在第7天，标准细菌、标准霉菌和环境腐败细菌的总数从初始值降至1000cfu/g以下，7～28天细菌、霉菌以及环境腐败菌总数没有增加，且一直稳定保持在100cfu/g以下，防腐效果最好。
②样品6#在第7天标准细菌、环境腐败菌从初始值降至1000cfu/g以上，虽14d～28d持续下降，但未能保持在100cfu/g以下，不能通过细菌挑战性实验。而标准霉菌在第7天从初始值降至10cfu/g以下，且保持稳定，通过霉菌挑战性实验。
③单独添加苯甲醇的石粉牙膏(样品1#、2#、3#)防腐效果不理想，虽含量为0.5%和0.4%时，能勉强通过细菌挑战性实验，但含量为0.3%时不能通过挑战性实验。
④防腐效果由好至差排序为：样品10#--1#--2#--6#--3#。
2.3 二次挑战性实验
因2.2实验结果中，环境腐败细菌的挑战性实验结果并不是很理想，而实验要更贴近实际生产，故在考虑了防腐体系的同时，重新设计石粉牙膏山梨醇配比，进行二次环境腐败细菌挑战性实验，研究防腐体系与牙膏基质配方的协同作用。调整后的配比如下，见表6。
表6 二次挑战性实验配比 单位：%
编号山梨醇苯甲醇丙酯钠丁酯钠11#300.5--12#300.50.10.113#320.5--14#320.50.10.115#450.5--
对环境腐败细菌的二次挑战性实验结果见表7。
表7 环境腐败细菌的二次挑战性实验结果
由表7可知：①样品14#在第7天环境腐败菌从初始值降至100cfu/g以下，且保持稳定，能优良通过环境腐败细菌挑战性实验。②样品12#在第7天环境腐败菌从初始值降至1000cfu/g以下，且保持稳定，能通过环境腐败细菌挑战性实验。③单独使用苯甲醇作为防腐体系时(样品11#、样品13#、样品15#)，不能在第7天将环境腐败菌从初始值降至1000cfu/g以下，提升效果不理想。
3 讨论与结论
本实验选择了苯甲醇作为主要防腐剂进行单方和复方防腐体系的筛选。通过采用LB肉汤抑菌实验及微生物挑战性实验，分析验证苯甲醇的防腐效果。另外，考虑牙膏中的山梨醇等原料自身的抑菌作用和促进防腐效果，以及苯甲醇在牙膏中的口感，故在进行微生物挑战性实验时，针对性的选择一定添加量的苯甲醇配比进行防腐效果比较。研究表明：①单独使用苯甲醇作为防腐体系时，随着苯甲醇含量的增加，防腐效果成正比；随着山梨醇含量的增加，防腐效果提高不明显。②苯甲醇与尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠复配作为防腐体系时，随着山梨醇含量的增加，防腐效果成正比。③32%山梨醇+0.5%苯甲醇+0.1%尼泊金丙酯钠+0.1%尼泊金丁酯钠防腐体系最好。
说明，在建立苯甲醇系列的牙膏防腐体系时，除了要考虑防腐剂的用量外，同时还要考虑牙膏基质等因素，使得样品有条件地通过挑战试验，使防腐体系对微生物有特强的抑杀作用；保证产品在生产、贮藏和使用时不容易被微生物污染，建立成本可控，更经济、更有效的防腐体系，保证产品品质。
