哺乳动物合子基因组激活调控的研究进展

邓明田，王 锋

（南京农业大学 动物科技学院／江苏省家畜胚胎工程实验室，南京 210095）

哺乳动物早期胚胎发育起始于精卵结合，受精卵经历重编程、母源-合子转换（maternal-to-zygotic transition，MZT）和合子基因组激活（zygotic genome activation，ZGA），完成附植前发育。在胚胎发育起始阶段胚胎基因组处于转录静止状态，胚胎发育完全由母源mRNA和蛋白调控，但在1～3次快速卵裂后，母源mRNA和蛋白被逐渐清除，ZGA开始启动，参与调控早期胚胎发育［1］。基于高通量转录组测序的研究发现，哺乳动物ZGA过程中约有35%的母源mRNA进一步降解，12% ～24%的合子mRNA启动表达［2-4］；而利用RNA合成阻断剂α-鹅膏菌素抑制ZGA发生，导致哺乳动物胚胎发育阻滞［5］。因此，ZGA作为早期胚胎发育的关键转折事件，其发生对早期胚胎发育和全能性的建立有着重要的意义。

研究发现，ZGA在不同物种中的发生时间和持续过程有着较大的差异。在小鼠胚胎中，ZGA由S／G2期次要的ZGA（minor ZGA）和2细胞期大规模的ZGA（major ZGA）组成［6］；大动物ZGA一般出现在4到16细胞期［3，5］，表明ZGA受多种不同因素的调控，如DNA甲基化、组蛋白甲基化和非编码RNA等表观遗传因素以及转录因子等。笔者就以上因素调控哺乳动物ZGA的机制予以综述。

1 哺乳动物ZGA发生的表观遗传调控

表观遗传是指造成基因表达发生改变，但不在DNA内进行编码的遗传修饰，是染色质调控的主要内容。核小体是染色质的基本单元，由H2A、H2B、H3和H4四个组蛋白组成八聚体，缠绕在长度为146 bp的DNA上。DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA及N6-甲基腺嘌呤（N6-Methyladenosine，m6A）等表观遗传修饰均能影响染色质重塑，调控ZGA过程。

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化主要出现在胞嘧啶的第5位碳原子（5-methylcytosine，5-mC）上，由DNA甲基化转移酶DNMT3A（DNA methyltransferase 3A）和DNMT3B建立，并由Uhrf1（Ubiquitin-like PHD and RING finger domain-containing 1）、PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）和DNMT1复合物维持。DNA甲基化还能被TET家族蛋白（Ten-eleven translocations）继续氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC），实现DNA去甲基化［7］。

研究发现，DNA甲基转移酶在早期胚胎发育过程中具有重要作用。例如敲除DNMT1引起X染色体失活（X chromosome inactivation，XCI）和胎盘发育异常［8］；敲除DNMT3A引起小鼠出生后死亡，敲除DNMT3B、Uhrf1和TET3均会导致小鼠胚胎致死［9-10］。小鼠胚胎发育过程中，父源基因组在minorZGA期经历迅速的去甲基化过程，而母源基因组和印记基因控制区域（imprinting control regions，ICRs）的5-mC水平基本维持不变，直至majorZGA过程中才逐渐去除（见图1）。DNA甲基化转移酶及去甲基化酶的缺失引起印记基因ICR甲基化及父源基因组去甲基化异常，影响基因表达，最终导致胚胎死亡。由于5-hmC含量极低，在单碱基水平难以检测，利用免疫荧光等方法发现在小鼠minor ZGA中，5-hmC在雄原核中逐渐升高［11］，可能也参与调控ZGA过程。

1.2 组蛋白甲基化

组蛋白甲基化是组蛋白主要的修饰形式之一，通常发生在H3和H4组蛋白的赖氨酸（K）残基上，目前广泛研究的赖氨酸甲基化位点包括组蛋白H3第4位（H3K4）、第9位（H3K9）、第27位（H3K27）、第36位（H3K36）和第79位（H3K79）及组蛋白H4第20位（H4K20），其中H3K4me3和H3K9me3调控ZGA发生的机制较为明确。

H3K4me3是转录激活的标志，由MLL（Mixedlineageleukemia）和WDR5等建立，并经KDM5（Lysine-specific demethylase 5）家族蛋白特异性去除，敲低WDR5和KDM5B均影响胚胎发育［12-13］。免疫荧光实验发现，H3K4me3在小鼠ZGA过程中逐渐降低，在majorZGA时期达到最低水平［14］；在猪和山羊胚胎ZGA过程中也处于最低水平［13，15］。利用超低量染色质免疫共沉淀（ChIP）技术，研究人员发现基因组上H3K4me3宽度与ZGA有关。在体细胞中，基因转录起始位点（transcriptional start sites，TSSs）附近普遍存在长度约为1 000 bp的H3K4me3峰。在小鼠卵母细胞中，存在第二种H3K4me3峰，长度可达100 kb，主要出现在TSS附近；大约22%的基因组存在这种宽H3K4me3修饰区域，可以保护基因组不被5-mC覆盖。在ZGA发生时，存在第三种H3K4me3峰，长度可达20 kb，主要出现在启动子和基因间区域，激活合子基因表达。ZGA的发生时，在KDM5A和KDM5B作用下第二种H3K4me3峰转变为第三种H3K4me3峰（见图2）。干扰KDM5A和KDM5B引起H3K4me3峰转变异常，导致小鼠胚胎发育阻滞［14，16-17］。因此，H3K4me3通过改变修饰类型，参与调控小鼠胚胎ZGA发生。

H3K9me2／3与HP1（Heterochromatin protein 1）作用促进染色质压缩和异染色质形成，抑制基因表达。哺乳动物ZGA过程中，H3K9me3被逐渐移除［3，15，18］。高绍荣课题组利用超低量ChIP-seq技术绘制了小鼠早期胚胎发育过程中H3K9me3动态变化图谱。小鼠早期胚胎发育过程中，H3K9me3标记区域逐渐由卵母细胞特异性区域向卵裂特异性基因和囊胚特异性区域过渡。同时逆转座子发生转录活化，其LTR区域DNA甲基化逐渐移除，H3K9me3逐步建立。CHAF1A作为核心因子，调控逆转录因子LTR区域H3K9me3修饰，干扰CHAF1A引起调控逆转录因子LTR区域H3K9me3水平降低，促进逆转录因子表达，导致小鼠胚胎发育阻滞［19］。另外研究发现，干扰TRIM28引起逆转座子H3K9me3和DNA甲基化水平降低，激活基因表达，导致小鼠胚胎发育阻滞在ZGA时期［20］，表明H3K9me3主要通过影响逆转座子表达调控小鼠ZGA发生。

1.3 非编码RNA

MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22 nt的非编码单链RNA分子，可通过靶向母源因子，参与调控早期胚胎发育［21］。例如，miR-125能抑制母源特异性表达基因SEBOX和LIN28A蛋白的表达，过表达miR-125导致小鼠胚胎发育阻滞在2细胞时期，干扰miR-125促进ZGA发生［22］。最近Yang F.等［23］发现miR-344靶向Zmym2／Lsd1参与调控小鼠早期胚胎发育，表明miRNA在ZGA发生中的重要作用；且miRNA位置上呈现出高度的保守性，序列上呈现出高度的同源性，研究miRNA调控ZGA发生的机制具有重要的参考价值。

与mRNA类似，lncRNA也在ZGA过程中发生母源降解和合子lncRNA转录［24-25］。近期研究发现，敲低lncRNA il17d引起il17d基因启动子甲基化水平升高，il17d基因表达水平降低，影响多能性基因Oct3／4、Klf4和c-Myc表达水平，同时胚胎凋亡水平升高，增殖能力降低，最终影响胚胎发育［26］。LncRNA LincGET可与hnRNPU、FUBP1和ILF2形成RNA-蛋白复合物，干扰lincGET促进GLN、内源性逆转录因子MERVL和ERVK的长末端重复序列的顺势调控活性，抑制RNA可变剪切，导致小鼠胚胎2细胞阻滞［27］。LincGET还能与CARM1形成复合体，建立激活型染色质修饰H3R26me2，增加全基因组染色质的开放程度，提高多能性基因表达水平，从而在ZGA过程中决定卵裂球命运［28］。因此，lncRNA是调控ZGA发生的重要因素之一，但lncRNA数量众多，功能复杂，仍需继续挖掘研究参与调控ZGA的lncRNA。

1.4 N6-甲基腺嘌呤

m6A是真核细胞RNA中最为丰富的一种内在修饰，参与调控基因表达。mRNA前体在METTL3（Methyltransferase Like 3）、METTL14和WTAP（WT1 Associated Protein）组成的甲基转移酶复合体作用下发生甲基化，并在去甲基化酶FTO（Fat Mass and Obesity-Associated Protein）和ALKBH5（AlkB Homolog 5）的作用下去甲基化。发生m6A修饰的RNA可被多个m6A结合蛋白识别并发挥不同的作用。其中，YTHDF2可在细胞质内识别3′-UTR 发生的m6A 修饰并与之结合形成YTHDF2-m6A复合物，介导RNA翻译或稳定性［29］。在斑马鱼胚胎发育过程中，敲除YTHDF2导致发生m6A修饰的母源mRNA半衰期延长，合子基因表达受阻，影响ZGA发生，导致胚胎发育迟缓［30］，表明m6A修饰也参与调控胚胎ZGA发生，但m6A影响母源和合子基因稳定性的机制仍不清楚［31］。

2 转录因子调控ZGA发生的机制

虽然在MZT过程中，大部分母源RNA发生降解，但是约有10%的母源物质被保留下来，参与调控ZGA发生，如敲除YAP的小鼠胚胎中80%的母源基因不能降解，同时近700个合子基因未能激活表达，导致胚胎阻滞在2细胞［32］；敲除BTG4的胚胎不能招募CNOT7脱腺苷酸酶促进母源物质降解，出现2细胞阻滞现象［33］，表明母源因子能作为转录因子影响ZGA的发生，也能指导母源mRNA的清除。

转录因子还能调节染色质可塑性，影响表观遗传修饰，如组蛋白去甲基化酶LSD1在GV期卵母细胞和合子中均有极高的表达量，敲除LSD1导致小鼠胚胎2细胞阻滞，且出现重编程异常的现象［34］。STELLA也称为DPPA3（Developmental pluripotency associated 3）或PGC7，能和Uhrf1形成复合体。在卵母细胞的发育中STELLA高水平表达，通过主动出核转运过程，防止Uhrf1在卵母细胞核内累积和DNA甲基化异常升高，调控卵母细胞成熟。研究发现，敲除STELLA的小鼠胚胎出现2细胞阻滞。一方面，Stella缺失导致沉默的基因组区域发生异常高甲基化，严重影响成熟卵子的质量和受ZGA过程中的母源基因组激活［35］；其次敲除STELLA引起逆转录因子激活失败，影响合子基因表达［36］；另外STELLA还能与印记基因H3K9me2结合，防止其ICR发生去甲基化［37］，表明转录因子能从表观遗传修饰等多个层面调控ZGA发生，是ZGA的重要调控因素。

3 展望

综上所述，ZGA作为早期胚胎发育的关键转折事件，其发生是一个复杂且高度协调的过程，受DNA甲基化、组蛋白甲基化和非编码RNA等表观遗传修饰和转录因子调控，构成了一个精细的多层次调控网络。由于ZGA过程中大量的mRNA和非编码RNA差异表达，挖掘其他驱动ZGA发生的因子仍是相关研究的重点；另外，ZGA过程中表观调控因子之间的相互作用也有待进一步探究。