基于营养液静置培养方式的蓝莓试管苗增殖研究
2020-07-07郭茹孙世海叶霞华仁锐
郭茹，孙世海，叶霞，华仁锐
（天津农学院园艺园林学院，天津300384）
蓝莓，又称越桔或蓝浆果，属于杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）植物，多年生落叶或常绿灌木。全世界约400 个种，广泛分布于北半球，以北美资源最为丰富。中国蓝莓栽培起步较晚，自20 世纪80 年代初，有关单位先后从国外引进100 多个蓝莓品种，并进行了栽培和育苗研究[1]。蓝莓果中含有花色素苷、黄酮等多种多酚类生理活性物成分，联合国粮农组织将蓝莓列为人类五大健康食品之一，同时被认为是21 世纪最有发展前途的新型高档果树树种[2-3]。蓝莓的常规繁殖方法较多，有种子育苗、绿枝扦插、硬枝扦插、根插和分株嫁接等，但繁殖系数低，生长速度慢，品种易退化[4-6]。利用组织培养的方法可以在短期内大大提高繁殖系数，缩短繁殖时间，并且可以保持品种的优良特性，现己成为近年来众多学者研究的热点之一[7-10]。多数研究者认为，玉米素（ZT）是促进越橘属植物离体快繁的最佳外源调节剂，比如蔓越橘、矮丛蓝莓、越橘加入ZT 后其离体繁育的增殖效果明显[11-12]。关于不同类型的支撑物在组培中的应用效果研究鲜少报道，国内有柴慈江[13-15]研究，以土壤作为支撑物，进行葡萄、珠美海棠以及栒子的生根培养。为了进一步研究提高生产效率，并降低生产成本，该试验通过探索不同支撑物、不同营养液浓度以及ZT 浓度对蓝莓试管苗静置培养增殖的影响，从而获得适合蓝莓试管苗增殖生长的最适培养条件，推动试管苗的大规模生产。
斯巴坦（Spartan）作为北高丛蓝莓的一种早熟品种，1978 年由美国农业部选育，由‘Earlyblue’בUS11-93’杂交育成。早产丰产、品质优良，极具栽培潜力。该研究以斯巴坦试管苗的茎段为外植体，对斯巴坦在不同增殖培养基上培养后的芽数、芽高、增殖系数、年繁殖数进行测定计算，观察蓝莓斯巴坦不同培养的生长特性，筛选出蓝莓斯巴坦的最佳增殖培养基，为蓝莓斯巴坦进一步大规模生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试品种取自天津农学院园艺植物组织培养实验室盆栽的蓝莓斯巴坦品种，取外植体进行初代培养，并且连续继代培养3 次后，保证组培苗的健壮。取组培苗高3.0±0.5 cm 且长势一致的蓝莓斯巴坦继代组培苗为增殖的接种材料。蛭石、珍珠岩均购自朝日物产（天津）园艺科技股份有限公司，其中珍珠岩用自来水淘洗3 遍后烘干备用。
1.2 试验方法
1.2.1 初代培养。供试蓝莓品种为斯巴坦，在春季蓝莓新枝生长旺盛时期的晴天上午选取当年生健壮的半木质化嫩枝，去除叶片，在流水下冲洗3～5 min，剪去顶端最嫩茎节。置超净工作台上，将其剪成2 cm 左右的带单芽的茎段，用75%的酒精消毒15 s 后，无菌水荡洗3 次，再用0.1%升汞溶液消毒7 min，无菌水荡洗5 次，每次30 s，备用。
1.2.2 增殖培养。将组培苗接入到不同的培养基中，即3因素3 水平正交试验[L9（33）]设计的诱导增殖培养基见表1。蓝莓斯巴坦增殖培养基成分见表2。试验设9 个处理，每个处理接种20 瓶，每瓶接入3 株，共计60 株。培养基pH 5.2±0.1。培养40 d 后统计植株长势、株高、增殖系数、年繁殖数。
表1 L9（33）因素及水平
表2 增殖培养基成分
计算公式：增殖系数=培养后总芽数/接种时总芽数×100%；
年繁殖数=m·Xn
其中，m：无菌母株苗数；X：平均每个培养周期的增殖系数；n：每年可增殖的周期次数。
使用100 mL 广口的培养瓶，以琼脂为支撑物的培养基分别添加蔗糖20 g/L、琼脂8 g/L；以蛭石、珍珠岩为支撑物的培养基，蛭石、珍珠岩的用量每瓶均为8 g，再加入营养液40 mL，各处理支撑物及相应营养液分装后，置于高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌20 min。
1.2.3 培养条件。将培养瓶放入培养室内，培养温度为23±2℃，光照强度为2000 lx，光照时间为12 h。
1.3 数据分析
采用Microsoft Excel 完成对数据的基本处理，采用SPSS17.0 软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 不同处理蓝莓试管苗增殖的生长状况
选取生长健壮且大小一致的蓝莓试管苗接种于增殖培养基上，接种15 d 后观察生长状况，40 d 调查芽数、芽高及芽生长势，并计算增殖系数和年繁殖数（40 d 为1 个周期，1 年繁殖9 次），不同处理结果详见表3。
表3 不同处理蓝莓组培苗增殖情况
在试验中发现，蓝莓斯巴坦的增殖随着不同的处理表现出不同的差异。接种15 d 后，处理4 和处理5 大部分在节间处形成芽，且处理4 的叶片大而绿，芽粗壮。处理1 和处理2 只有少部分在节间处形成芽，芽小且叶片呈淡绿色。接种40 d 后，对其增殖系数、平均芽高和年增殖数进行数据统计分析，调查蓝莓斯巴坦组培苗在9 个不同处理中的增殖情况。由表3 可知，处理4 增殖系数最高，为5.14，采用这一技术，理论上1 株试管苗1 年可以生产蓝莓组培苗约为2505733.52 株，明显超过其他处理。结合蓝莓幼苗的生长状况，较优的处理是处理1、处理2、处理4 和处理5。根据正交试验结果，分别对各处理的增殖系数和平均芽高进行极差分析（表4）。
2.2 不同因素对蓝莓试管苗增殖影响的极差分析
不同因素对蓝莓丛生芽增殖影响的极差分析如表4所示。根据各因素的极差值来分析其对蓝莓斯巴坦组培苗增殖的影响程度，R 值越大说明影响越显著。
由表4 可知，各因素对蓝莓斯巴坦试管苗增殖情况的影响大小不同，且影响的规律也不相同。支撑物、营养液、ZT 浓度3 个因素对增殖系数的影响大小顺序为支撑物＞ZT 浓度＞营养液浓度，支撑物对蓝莓斯巴坦增殖效果的影响最大，而营养液浓度的影响最小；对平均芽高影响大小顺序为支撑物＞营养液浓度＞ZT 浓度，支撑物对蓝莓斯巴坦增殖效果的影响最大，而ZT 浓度的影响最小。
表4 不同因素对蓝莓试管苗增殖影响的极差分析
2.3 不同因素对蓝莓试管苗增殖影响的方差分析
不同因素对蓝莓斯巴坦丛生芽增殖的影响方差分析如表5 所示。由表5 可知，支撑物、培养物和ZT 浓度3 个因素对增殖系数和平均芽高的影响均达到了显著差异。因此需要对支撑物、培养物和ZT 浓度各水平作进一步的多重比较分析。
表5 不同因素对蓝莓试管苗增殖的影响方差分析
2.4 不同因素对蓝莓试管苗增殖影响的多重比较
支撑物、培养基、ZT 浓度各水平增殖系数差异显著。因而还需进行支撑物、培养基、ZT 浓度各水平增殖系数的多重比较。详见表6～8。
由表6 可知，支撑物为珍珠岩处理的平均增殖系数最高达到3.5421，支撑物为琼脂和支撑物为蛭石处理的差异不显著，二者均与支撑物为珍珠岩处理差异显著，其中，支撑物为蛭石处理的增殖系数最低，为1.5491；珍珠岩处理的平均芽高最大，为3.2600 cm，3 种不同支撑物处理的间的平均芽高均达到极显著水平。
表6 支撑物各水平LSD 检验
由表7 可知，营养液WPM 处理的平均增殖系数最高，达到3.1716，其中WPM 处理与1/4WPM 处理差异极显著，二者均与1/2WPM 处理差异显著；WPM 处理的平均芽高最大，为2.7744 cm，与1/2WPM 处理的差异达显著水平，与1/4WPM 处理的差异达到极显著水平，1/2WPM 处理和1/4WPM 处理的差异也达到极显著水平，1/4WPM 处理的平均芽高最低，为1.2267 cm。
表7 营养液浓度各水平LSD 检验
由表8 可知，1 mg/L ZT 处理的平均增殖系数和平均芽高均最大，分别为3.3194 和2.5489 cm，0.5 mg/L ZT处理与1.2 mg/L ZT 处理差异不显著，二者均与1 mg/L ZT 处理差异显著。综合正交试验和方差分析结果得知，营养液静置培养增殖的最优水平可设定为珍珠岩+WPM+1mg/LZT。
表8 ZT 浓度各水平LSD 检验
3 结论与讨论
目前，部分蓝莓的组培快繁体系已经在MS、WPM、改良WPM 等基本培养基上成功建立。蓝莓在WPM 培养基上有较高的增殖系数和株高。所以，该试验研究不同倍数WPM 作为营养液的增殖效果。传统组培用蔗糖作为支撑物起到固定作用，进行增殖培养，在蓝莓组织培养过程中，细胞分裂素对芽的诱导和增殖起到至关重要的作用，其中ZT 是蓝莓丛生芽诱导和增殖中使用最为广泛的一种，且其用量在蓝莓不同品种中也存在差异，所以值得进一步探究适合蓝莓斯巴坦增殖的ZT 浓度。
试验利用正交设计进行了极差和方差分析，比较了影响蓝莓斯巴坦增殖的主要因素，以此筛选出蓝莓斯巴坦增殖组织培养适宜的培养条件。在植物离体快繁中，支撑物、培养基以及ZT 浓度都会影响组培苗的生长和分化，其中支撑物对增殖系数和芽高的影响最大。该研究结果表明蓝莓斯巴坦在以珍珠岩为支撑物时，长势优于以琼脂为支撑物和以蛭石为支撑物。当支撑物相同时，以WPM 为营养液的处理效果最佳，增殖系数和芽高都好于其他2 个浓度。以琼脂为支撑物，处理1 和处理2 芽数相对较多且较高；处理3 的平均芽数相对较少，叶片呈淡绿色。以珍珠岩为支撑物，处理4、处理5 的芽在高度上明显高于其他处理，且叶片呈绿色；处理4 的增殖系数高达5.14，生长旺盛，分支多，植株粗壮，而且植株较高。以蛭石为支撑物，处理7、处理8 和处理9 的芽相对较矮，且数量少，但是叶片都呈绿色。通过试验得到如下结论：蓝莓最适丛生芽增殖的培养基为珍珠岩+WPM+1 mg/L ZT，对组培育苗技术的推广应用具有重要意义。
