PTP4A3基因在胃癌患者中的表达及对肿瘤细胞MGC-803活性的影响

刘明双

(航空工业三六三医院；西南医科大学附属三六三医院，四川 成都 610000)

胃癌的发生是一个多种基因共同参与的复杂过程[1-2]，目前胃癌患者5 a生存率处于较低水平[3]，因此，探讨胃癌发生与发展的分子机制，对改善患者疗效有重要意义.蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)广泛表达于人体多个组织器官，参与多种生物学行为[4].PTP4A3基因编码属于PTP家族的蛋白，在肝细胞癌、胶质瘤中的作用已有系统研究[5]，但在胃癌发生与发展中作用的研究较为少见.本研究首先检测了胃癌组织与癌旁正常胃组织中PTP4A3基因编码蛋白表达的差异，并通过体外细胞学实验进一步探讨了PTP4A3基因表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

组织来源：收集2018年3月—2019年6月在西南医科大学附属三六三医院手术切除的胃癌组织标本156例，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期76例，Ⅲ～Ⅳ期80例；分化程度：高分化72例，中分化76例，低分化8例.另收集癌旁正常胃组织标本32例作为对照，组织收集经医院伦理委员会审核批准.入组标准：首次行手术治疗的胃癌患者；无放化疗、免疫治疗史.排除标准：合并胰腺癌、结直肠癌、肝癌等其他恶性肿瘤的患者.

细胞系：人胃癌细胞MGC-803(通派(上海)生物科技有限公司).

主要试剂：胎牛血清、RPMI-1640培养基(苏州艾莱萨生物科技有限公司)；脂质体2000(上海瑶韵生物科技有限公司)；兔抗人PTP4A3多克隆抗体、HRP标记的二抗(上海笃玛生物科技有限公司)；CCK-8检测试剂盒、Transwell小室(上海翰宇生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 标本组织中PTP4A3基因编码蛋白表达

应用RIPA裂解液提取组织标本总蛋白，应用BCA法进行蛋白定量，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转模至PVDF，封闭2 h，滴加兔抗人PTP4A3多克隆抗体(1∶300)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶500)，4 ℃过夜，加入HRP标记的二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育2 h，ECL显色，凝胶成像系统拍照，Image J分析各条带灰度值.

1.2.2 人胃癌细胞MGC-803培养与转染

将人胃癌细胞MGC-803加入含RPMI-1640的完全培养基中，按6×105个/孔的密度将细胞接种于6孔板，常规培养，收集对数期细胞用于后续实验.根据脂质体2000试剂说明书进行细胞转染，分别加入空质粒(PTP4A3-NC组)、PTP4A3基因干扰质粒(PTP4A3-siRNA组)，同时设置空白对照组，培养24 h后，培养基中滴加G418，继续培养72 h后筛选稳定转染的MGC-803细胞，并通过RT-PCR和Western blot进行鉴定.

1.2.3 CCK-8法检测人胃癌细胞MGC-803的增殖能力

取对数期细胞，胰蛋白酶消化，1×104个/孔密度加入96孔板中，使用RPMI-1640完全培养基培养，设置5个复孔.分别培养24、48、72、96 h，向对应孔中加入CCK-8溶液，反应2 h，应用全自动酶标仪测定490 nm处吸光度值.

1.2.4 Transwell实验

实验前24 h，将培养基更换为无血清的RPMI-1640培养基，对MGC-803细胞进行饥饿处理.Transwell迁移实验：将细胞消化后重悬计数，上室中加入无胎牛血清的RPMI-1640培养基，将细胞浓度稀释至3×105个/mL，下室中加入RPMI-1640完全培养基，培养24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色，光学显微镜下计数.Transwell侵袭实验：无血清的RPMI-1640培养基与基底胶混合后加入上室，将细胞浓度稀释至3×105个/mL，其余操作同迁移实验.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 胃癌组织和正常胃组织中PTP4A3基因编码蛋白表达水平

胃癌组织中PTP4A3基因编码蛋白相对表达量为0.92±0.04，明显高于正常胃组织中的表达量0.21±0.07，差异具有统计学意义(t=18.492，P=0.001).见图1.

2.2 PTP4A3-siRNA转染后MGC-803细胞中PTP4A3 mRNA和蛋白表达水平

PTP4A3-siRNA组MGC-803细胞中PTP4A3 mRNA和蛋白相对表达量明显低于空白对照组、PTP4A3-NC组，差异具有统计学意义(P<0.01)；PTP4A3 mRNA和蛋白相对表达量PTP4A3-NC组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05).见表1、图2.

表1 各组MGC-803细胞中PTP4A3 mRNA和蛋白相对表达量

组别nPTP4A3 mRNAPTP4A3蛋白空白对照组50.73±0.170.85±0.11PTP4A3-NC组50.76±0.150.88±0.09PTP4A3-siRNA组50.21±0.08ab0.26±0.14abF16.39115.057P0.0010.001

注：a.与空白对照组比较P<0.01；b.与PTP4A3-NC组比较P<0.01.

2.3 PTP4A3表达下调对MGC-803细胞增殖活性的影响

培养24 h时，空白对照组、PTP4A3-NC组、PTP4A3-siRNA组MGC-803细胞增殖能力之间差异无统计学意义(P>0.05)；培养48、72、96 h时，PTP4A3-siRNA组MGC-803细胞增殖能力明显低于空白对照组、PTP4A3-NC组，差异具有统计学意义(P<0.05)，PTP4A3-siRNA组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05).见表2.

表2 不同培养时间各组MGC-803细胞增殖活性

组别nt/h24487296空白对照组50.64±0.131.97±0.183.70±0.357.27±0.50PTP4A3-NC组50.68±0.152.06±0.163.93±0.517.41±0.73PTP4A3-siRNA组50.66±0.100.84±0.31ab1.58±0.63ab3.15±0.92abF0.3397.20514.57116.095P0.7150.0330.0010.001

注：a.与空白对照组比较P<0.05；b.与PTP4A3-NC组比较P<0.05.

2.4 PTP4A3表达下调对MGC-803细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell实验显示：PTP4A3-siRNA组迁移和侵袭细胞数明显少于PTP4A3-NC组和空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；迁移和侵袭细胞数在PTP4A3-NC组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05).见表3，图3～4.

表3 各组MGC-803细胞迁移和侵袭细胞数

组别n迁移细胞数侵袭细胞数空白对照组5172±38158±31PTP4A3-NC组5179±34155±29PTP4A3-siRNA组560±1849±15F25.49122.308P0.0010.001

3 讨 论

目前，进展期胃癌患者术后5 a生存率仍低于50%[6]，影响胃癌预后的因素较多，包括疾病早期诊断率偏低，术后胃癌细胞易复发、迁移和侵袭等.近年来，随着免疫疗法、基因疗法等新治疗手段的出现，给胃癌的临床治疗带来了新希望，但由于胃癌发病机制和细胞生物学行为仍未完全阐明，导致对患者预后的改善程度并不理想.PTP是一种经典的非跨膜型蛋白酪氨酸酶，可调控细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等多个过程[7].PTP4A3基因编码的蛋白质属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，在肝细胞癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤中存在高表达[8-9].但PTP4A3基因编码的蛋白在胃癌组织中的表达特点及对癌细胞增殖、分化、迁移等过程的影响仍鲜有研究报道.本研究显示：胃癌组织中PTP4A3基因编码蛋白表达水平明显高于正常胃组织，提示PTP4A3基因可能在胃癌发生、发展中具有重要作用.

本研究通过体外细胞学实验来进一步阐明PTP4A3对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及调控机制.通过RNA干扰技术抑制人胃癌细胞MGC-803中PTP4A3基因表达的结果显示：培养48、72、96 h时，PTP4A3-siRNA组MGC-803细胞增殖能力明显低于空白对照组、PTP4A3-NC组，提示下调人胃癌细胞MGC-803中PTP4A3基因表达后，可有效抑制细胞增殖.相关研究[10]显示：PTP4A3表达下调能够抑制胶质瘤细胞的增殖，与本研究结论一致.癌细胞迁移和侵袭是术后病情复发和死亡的主要原因，降低肿瘤细胞迁移和侵袭能力对改善治疗预后具有重要意义[11].本研究中PTP4A3-siRNA组迁移和侵袭细胞数明显少于PTP4A3-NC组和空白对照组，提示下调PTP4A3基因表达可有效降低胃癌细胞迁移和侵袭能力.相关研究[12-13]显示：PTP家族是整合素受体信号通路的正向调节因子，而整合素受体信号通路直接影响到细胞黏附能力，抑制PTP家族成员的表达能够降低细胞黏附性.因此，本研究中PTP4A3基因对胃癌细胞迁移和侵袭能力的调控作用可能通过整合素受体信号通路实现，对胃癌的早期诊治提供了依据，但具体机制仍需进一步深入研究.