基于RBC睴CS睩e3O4磁性纳米粒子自组装与磁控制癌细胞运动的研究

彭逸舟 段金娣

摘 要：晚期癌症的高死亡率迫使科学家寻找新的治疗方案，判定癌症晚期的直接指标就是有远处的转移发病灶，癌细胞的转移途径主要以血行转移为主，应用Fe3O4对进入循环系统的癌细胞磁分离研究应运而生，本课题以红细胞膜、壳寡糖、Fe3O4共组装的新型磁性粒子用于赋予癌细胞磁响应性，用磁场引导癌细胞运动。该粒子具有长循环性，磁响应性且有针对不同癌细胞装载不同治疗药物的潜能。

关键词：癌细胞磁性控制;红细胞膜;靶向;吸附

目前癌症仍然是威胁着全世界人类的一大疾病杀手，由于癌症发病隐匿，早期进程中，病人因几乎难有临床症状而忽略检查，当癌症症状如挤压器官压迫神经引发疼痛等情况的产生往往发生在已有癌细胞转移的IV期，晚期病人的低治愈率和高死亡率呼唤着科学家采取积极的应对措施，癌症IV期时，出现的远处脏器的转移大多数是由血行转移的，从入血这个阶段开始通过各种手段把癌细胞从血中分离清除掉，可减低癌细胞扩散的速度，降低实质脏器因癌细胞转移入侵的损害机率。基于磁动力学原理设计出的癌细胞磁分离技术是一种成本低效率高效果显著的方法，这是目前新提出的一种有效清除血液中的癌细胞的治疗兼并检测技术。

壳寡糖有着出色的分散稳定性和对多种分子和离子高度亲和吸附的性能，其多氨基和多羟基结构易于形成氢键，易于修饰纳米粒子和脂质膜的层层组装。Fe3O4有灵敏的磁响应性、易制备性还有显著的加速传质传热的性能，有利于赋予周围结构磁响应性和向周围动量热量的传递，用来做磁珠光热疗法的极好材料。红细胞膜通过与壳寡糖的粘附性在纳米粒子周围包裹上一层柔性脂质膜，形成有弹性的复合壳寡糖—脂质体外壳，能缓冲金属氧化物粒子的硬度，以减低纳米粒子群在血流中运动时对周围细胞组织的摩擦性损害，同时降低单个粒子密度，提高悬浮稳定性，阻隔磁性粒子间的团聚沉降，减少血管被阻塞的可能，膜上的蛋白质和特异性糖原，能给予纳米粒子有效的伪装性，使之在血液中逃避掉免疫细胞的识别和吞噬，能在血中起到长循环的效果，使之有充分的时间寻找和靶向吸附癌细胞。

一、纳米粒子的制备过程

壳寡糖共混入三口烧瓶，加入200ml去离子水，超声30s，溶解混匀，将Ar2瓶用长针头一侧口插入烧瓶，主口装气球，另一侧口插入细针头，45摄氏度下搅拌20min，用注射器逐滴加入TPP，见黄色透明溶液变成半透明黄色乳光液，升温至60摄氏度再度搅拌10min，逐滴加入NaOH，见黄色溶液从中间开始渐变为红色，随pH值升高，继发变成全黑色，即停止加碱，最高转速搅拌3h，升温至80摄氏度，停搅拌静置熟化30min，磁分离粒子，用乙醇和水洗涤至中性，真空干燥12h，收集回深咖啡色粉末，研磨称重。

去纤维化抗凝羊血（300ml），离心，去上清，用冰PBS洗涤，反复四至五次，用冰1/4PBS低渗破碎细胞膜1h，离心，去上清，用冰PBS洗涤，反复多次，可超声破碎1-2次，直到留下粉色或白色细胞膜沉淀，超声20min，4摄氏度保存。牛黄胆酸钠，红细胞膜，混合溶入10ml乙醇，超声混匀后装入注射器，迅速注入45摄氏度PBS溶液100ml，旋蒸20min，DSPE-PEG-FA、DSPE-PEG-FITC，红细胞膜∶DSPE-PEG-X=20∶1（M/M）混合37摄氏度搅拌1小时。再用脂质体挤出器挤出七次，4摄氏度13000r/min离心，冰PBS洗涤，超声重分散，反复三次，4摄氏度PBS保存。将由本课题组2019级的本科毕业生段金娣配制的用油酸钠和聚乙二醇6000制成分散剂溶液与OCS-Fe3O4粒子共混超声5min，红细胞膜与Fe3O4粒子共混搅拌加热至45摄氏度，挤出器45摄氏度水浴，再将Whatman膜放入脂质体挤出器，多次挤出。离心去上清，再超声数十秒重分散在PBS溶剂里。反复三次后，50nm超滤膜过滤48h。

细胞表征实验：癌细胞与纳米粒子靶向亲和力检测：将修饰好荧光剂的纳米粒子与癌细胞混合均匀共孵育48h，再用胰酶消化，吹打，种板24h后，用高内涵拍照。培养瓶置于倒置显微镜下，在一边放上磁铁，拍下癌细胞随磁场的运动。

由实验结果可知，纳米粒子高度分散性和稳定性，磁性粒子与癌细胞吸附后，可充分赋予癌细胞磁响应性，可随磁场运动。

二、结论

本文以Fe3O4为磁核材料，壳寡糖OCS为分散剂和稳定剂，红细胞膜作为免疫逃避保护膜，用同步吸附共沉淀法和高压挤出法制备出用于在全血中分离癌细胞的纳米磁珠红细胞膜-OCS-Fe3O4其能精准充分赋予癌细胞磁响应性，其能在人工磁场中被磁力吸引运动。综上所述，本文合成了一种可靶向赋予癌细胞磁响应性的长循环纳米粒子，可用于控制癌细胞从血细胞中磁性分离，为癌细胞透析的临床应用提供了基础性研究。

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