佛甲草醇提物对佐剂性关节炎大鼠脾脏炎症相关蛋白表达的影响

曹性玲，吴丽珍，麻海娟，曾丽梅，周 青

(赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种病因不明的全身性自身免疫性疾病，以慢性破坏性关节病变为特征，多表现为关节疼痛、肿胀及功能障碍，致残率高。 目前临床用于治疗RA的药物主要以非甾类抗炎药、激素和细胞毒类药物等西药为主，这些药物往往毒副作用大，可造成肝肾损害、骨髓抑制、高血压等，并且这些药物的免疫抑制作用会使人体正常的免疫功能大大降低，从而使患者易患各种感染性疾病。因此总体来说疗效并不是很理想，患者经常很难坚持用药，使得治愈率很低[1]。

应用中医药治疗RA的历史很长并具有实际疗效，其机制可能与调节免疫机能、改善血液流变性和微循环、抗自由基损伤、调控细胞因子等有关[2-3]。中医药不仅来源广泛、毒副反应小，而且具有多环节、多层次、多靶点综合作用的特点，从中寻找具有优良抗RA活性的有效成分现已成为药物研发的重要途径。佛甲草(Sedum Lineare Thunb, SLT)为《中药大辞典》收载的中药材，是景天科植物佛甲草的全草，味甘、寒、无毒，具有清热、解毒、消肿、利胆等功效，传统中医用于咽喉肿痛、痈肿、疔疮、烫伤、蛇咬伤、痢疾、黄疸等。本课题组前期研究结果表明，佛甲草可显著降低急性和慢性炎症反应，并对免疫功能具有调节[4]。在佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠动物模型上，可以观察到佛甲草醇提物通过调节机体的免疫功能、减少炎性细胞因子及炎性介质的生成，抑制急性和继发性关节炎，降低脾脏指数。本实验拟进一步探究SLT对佐剂性关节炎大鼠的作用，观察其对细胞炎性因子及相关信号通路蛋白表达的影响，以推测SLT治疗AA的机制。为将佛甲草开发为治疗类风湿性关节炎的有效药物提供理论依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1实验药物佛甲草醇提物：佛甲草晒干后粉碎至粗粉，取适量蒸馏水加热提取3次，每次30 min，过滤，合并3次滤液并浓缩至适量，加入相当浓缩液3倍量95%乙醇，放置冰箱48 h后减压过滤，滤液回收乙醇至无醇味并浓缩成2.5 g·mL-1的溶液，实验前用生理盐水稀释至所需浓度供用；雷公藤多苷片(Tripterygium wilfordii glycosides tablet, TPT)，黄石飞云制药有限公司生产，批号：20101001。

1.2动物Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，雄性，体重(180±20) g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证书编号：SCXK(湘)2016-0004。实验前进行适应性饲养1周。

1.3试剂完全弗氏佐剂(complete freund's adjuvant, CFA)，Sigma公司，货号：129K8700；β-actin一抗(Ta-09)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG(ZB-2303)及山羊抗鼠lgG(ZB-2305)，北京中杉金桥生物技术有限公司；IL-1β(sc-7884)、IL-17(sc-374218)、IL-10(sc-365858)、NF-κB(sc-114)一抗，Santa Cruz公司；α7nAChR(ab23832)和TNF-α(ab66579)一抗，Abcam公司；BSA蛋白浓度测定试剂盒，北京天根生化科技有限公司(J8830/M2114)；HRP化学发光试剂盒，美国赛默飞世尔科技公司(1856135/1856136)。

1.4方法

1.4.1分组、动物模型制备及给药24只SD大鼠，随机分为：正常对照组、佐剂性关节炎模型组、4 g·kg-1佛甲草醇提物治疗组，8只/组。各组大鼠左后足常规消毒后，于足底皮下注射0.1 mL CFA致炎，正常对照组注射0.1 mL生理盐水。第7 d加强一针，复制佐剂性关节炎模型。从造模前3 d一直到造模后的第16 d，各组分别给予佛甲草醇提物和等量的生理盐水，ig，1次/d。

1.4.2 Westernblot方法检测脾脏组织中蛋白表达水平取20 mg脾脏组织于1.5 mL离心管中，加入200 μL裂解液，捣碎后，再加入400 μL裂解液，置于4 ℃颠倒混匀1 h。12 000×g，4 ℃，离心5 min。取上清液BCA法行蛋白定量。总蛋白50 μg，加缓冲液， 95 ℃，5 min，10% SDS-PAGE凝胶电泳分离。将分离出的蛋白转移至醋酸纤维素膜，加3%～5%的牛奶，封闭1 h。不同的膜分别TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10、NF-κB和a7nAChR一抗孵育，4 ℃过夜。二抗室温孵育1 h。将化学发光试剂盒中的两种试剂按1∶1比例混合，混匀后，在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1 min，于超高灵敏度化学成像发光仪照相，仪器自带软件测定各条带灰度值，与相应的内参比较后，将正常组值定为1，计算其余组相对值。

2 结 果

2.1佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏NF-κB及细胞因子蛋白表达的影响如图1～7所示，与正常对照组比较，佐剂性关节炎模型组大鼠脾脏TNF-α(P<0.001)、IL-1β(P<0.01)、IL-17(P<0.05)及NF-κB(P<0.05)蛋白表达升高，a7nAChR(P<0.05)表达降低，IL-10(P<0.01)表达变化不明显；与模型组比较，4 g·kg-1SLT治疗组TNF-α(P<0.01)、IL-1β(P<0.05)、IL-17(P<0.05)及NF-κB(P<0.05)蛋白表达降低，IL-10(P<0.01)及a7nAChR(P<0.01)表达升高。

图1 佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏NF-κB及细胞因子蛋白表达的影响

图2 佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏TNF-α的影响

注：F=16.963，P=0.000 9，正常组与模型组比较：q=6.793，***P<0.001；治疗组与模型组比较：q=7.431，##P<0.01。

图3 佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏IL-1β的影响

注：F=11.391，P=0.003 4，正常组与模型组比较：q=6.749，**P<0.01；治疗组与模型组比较：q=3.485，#P<0.05。

图4 佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏IL-17的影响

注：F=8.846，P=0.012 1，正常组与模型组比较：q=5.554，*P<0.05；治疗组与模型组比较：q=4.770，#P<0.05。

图5 佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏IL-10的影响

注：F=15.740，P=0.000 8，正常组与模型组比较：q=0.271，P>0.05；治疗组与模型组比较：q=6.596，##P<0.01。

图6 佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏NF-κB的影响

注：F=5.890，P=0.018 2，正常组与模型组比较：q=4.667，*P<0.05；治疗组与模型组比较：q=3.701，#P<0.05。

图7 佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏a7nAChR的影响

注：F=18.185，P=0.002 8，正常组与模型组比较：q=3.539，*P<0.05；治疗组与模型组比较：q=8.490，##P<0.01。

3 讨 论

RA是临床上常见的慢性、炎症性、渐进性的自身免疫性疾病，目前尚无有效的治疗方法。它的病变特征主要有滑膜炎以及关节腔内血管内皮生成，可导致多关节、对称的侵入性炎症，使得骨软骨损伤、关节被破坏以及关节畸形[5]，甚至还可导致多器官损伤[6-7]。因此，治疗RA首先要减少炎症反应。大鼠AA模型的临床表现、病理变化等与人类RA非常相似，是常用的一种免疫性炎症模型。我们前期研究发现AA大鼠模型组原发性、继发性足肿胀非常明显，佛甲草醇提物(4, 8 g·kg-1)能明显抑制AA大鼠原、继发性足跖肿胀程度，对大鼠AA有明显改善作用。

迄今，RA的病因还不太明确，有研究显示，促炎细胞因子和抗炎细胞因子的失平衡在RA的发病中有显著作用[8-9]。我们的前期研究发现，SLT显著降低AA大鼠血清TNF-α、IL-6水平及关节液PGE2含量，降低脾脏指数。提示SLT可调控AA发病时细胞因子网络的失调，脾脏参与其中。

NF-кB在正常情况下位于细胞胞浆内，以p65/p50异源二聚体形式存在，在静息状态下，NF-кB与其天然性抑制因子IкB结合在一起形成复合物，IкB阻止NF-кB进入细胞核，调控相关的靶基因。NF-кB信号通路参与多种免疫炎症的调节[10]。有研究表明NF-кB与炎性细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6等)之间具有相互作用，可彼此激活、调控[11-12]，这两者的共同作用可使得炎症加剧。当减少NF-κB的表达时，RA的症状可显著减轻[13-15]。 因此抑制NF-кB及炎性细胞因子的表达是治疗RA的一个重要切入点[16-17]。

α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholiner receptor, α7nAChR) 由同源五聚体所组成，属于神经元型乙酰胆碱受体，是一种配体门控离子通道，在胆碱能抗炎通路(Cholinergic Anti-Inflammatory Pathway，CAP)中发挥重要作用。胆碱能抗炎通路是神经-免疫调节通路中的一种，在全身炎症反应中有重要作用，可通过抑制炎性细胞因子的合成和释放，对炎症的发生发挥作用[18-22]。

本实验结果显示，佛甲草醇提物(4 g·kg-1)可明显降低AA大鼠脾脏组织中NF-кB p50的表达，同时TNF-α、IL-1β、IL-17等促炎细胞因子表达降低，抑炎细胞因子IL-10及α7nAChR表达升高。由此推测佛甲草醇提物对AA大鼠关节炎症的治疗作用可能与抑制NF-κB信号通路、激活胆碱能抗炎通路、调节机体的免疫功能和细胞因子网络平衡有关。