基于Nrf2/Keap1/ARE通路研究槲皮素对小鼠年龄相关性黄斑变性的保护作用

陈婷妍，周 洋

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)是老年人失明最常见的原因，全球患病率为8%[1]。近三分之一的早期ARMD发展为新生血管性ARMD(nARMD)。衰老、遗传、饮食、吸烟、肥胖和血管疾病都与ARMD的发病机制有关[2]。转录因子NF-E2相关因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是一种关键转录因子，已被确定能够激活抗氧化反应[3]。正常生理情况下，Nrf2与Keap1蛋白存在于细胞质中，处于相对稳定状态。当受到氧化应激因子等刺激后，Nrf2与Keap1迅速解离，并从细胞质进入细胞核，与抗氧化反应元件(anti-oxidative response element,ARE)结合[4]。此外，最近的研究还发现，Nrf2信号传导是抗氧化酶去除活性氧(reactive oxygen species,ROS)和其他有害物质并保护身体免受氧化应激所必需的关键途径[5]。槲皮素(Quercetin)为壳斗科植物伊比利亚栎的皮和叶中提取的苷类化合物，能够抑制离体恶性细胞的生长、抑制癌细胞DNA、RNA和蛋白质合成[6]。同时还能抑制血小板聚集和5-羟色胺的释放，对ADP、凝血酶和血小板活化因子诱导的血小板聚集均有明显抑制作用。但槲皮素在年龄相关性黄斑变性治疗方面研究甚少。本课题将研究槲皮素是否通过Nrf2/Keap1/ARE通路对年龄相关性黄斑变性小鼠具有保护作用，进一步探讨其作用机制，为临床上治疗年龄相关性黄斑变性提供新的理论依据。

1材料和方法

1.1材料60只体质量18～22g昆明小鼠购自中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司，本研究经过了我院的伦理审查。SOD试剂盒(批号:CSB-E14981r)、GSH-Px试剂盒(批号:CSB-E12146r)、CAT试剂盒(批号:CSB-EL004563PL)、MDA试剂盒(批号:CSB-E08588r)购于美国CUSABIO公司。RIPA裂解液(批号:R0020-100)购自北京索莱宝科技有限公司。多克隆抗体Nrf2(批号:ab76026)、多克隆抗体Keap1(批号:ab139729)、多克隆抗体LaminB1(批号：ab16048)、单克隆抗体HO-1(批号:ab1894911)、单克隆抗体NQO-1(批号:ab34173)、单克隆抗体GCL(批号:ab207777)、单克隆抗体GAPDH(批号:ab8245)购自美国Abcam公司。山羊抗兔IgG二抗(批号:2985S)和山羊抗鼠IgG二抗(批号:5873S)购自美国Cell Signaling Technology公司。PVDF膜(批号:IPVH08130)购自Millipore公司。HE试剂盒(批号:ZF-0328)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。切片机RM2016(货号:20160032)购自德国徕卡公司。多功能微孔板读板机 Molecular Devices(货号:SpectraMax iD5)购自美国Molecular Devices公司。倒置生物显微镜(批号:CKX53)购自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1动物分组与给药将60只昆明小鼠在室温(25℃±2℃)下保持12h黑暗/光照循环饲养。小鼠喂养适量的水和正常的饲料，并且在开始实验之前使小鼠适应环境至少2wk。将小鼠分别随机分为3组：对照组、模型组和槲皮素组，每组20只。造模3d后，槲皮素组小鼠给予槲皮素200mg/(kg·d)灌胃治疗30d，对照组和模型组则同步给予等体积生理盐水，每天定点给小鼠灌胃。

1.2.2模型制作参照Sykes等[7]和Hansson[8]方法制作光损伤装置。光照箱的上方安装排风孔，下方安装排气孔，并且在箱内放置两个有机玻璃透明箱，其体积为40cm×25cm×25cm。光照箱的每个面都安装白色荧光灯管，且箱内中心向各方向照度2000Lx，箱内的温度应与动物房间内的温度一致，控制在23℃～27℃。小鼠均在12h明(20～50Lx)和12h暗(0～12Lx)的循环光环境中适应7d，在玻璃乙醚麻醉缸中逐只放入小鼠约3min进行吸入麻醉，待小鼠麻醉后，缝线开睑。小鼠清醒后逐只进入光照箱，接受12h持续光照射。光照结束后立即拆除开睑缝线，送回暗环境中。实验前预留出正常小鼠。在造模过程中，模型组死亡1只小鼠。造模结束后进行眼底照相检查：小鼠眼底出现大量黄白色似玻璃膜疣物质，说明造模成功，可进行后续的实验。

1.2.3小鼠眼底检查和OCT检查小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，用Retina Imaging System给小鼠眼底照相。使用SD-OCT检测小鼠视网膜厚度。

1.2.4 HE染色观察小鼠视网膜形态的改变取小鼠视网膜标本，在4%多聚甲醛溶液中固定过夜。脱水后，石蜡包埋，切片，厚度为4μm，并在65℃下烘烤1h。接下来，将切片脱蜡并用苏木精和曙红染色。最后，在倒置显微镜下观察视网膜形态的改变情况。

1.2.5 FFA观察小鼠眼底血管完整性小鼠麻醉后用复方托吡卡胺滴眼液进行散瞳，腹腔注射荧光素溶液，在注射5min后定量荧光素渗漏斑点。

1.2.6小鼠视网膜电图使用Espion视觉电生理系统记录视网膜电图。将小鼠暗适应过夜，用强度为600(cd·s)/m2的Ganzfeld光刺激器通过闪光刺激引发视网膜电图。记录并分析双眼中的a波和b波振幅。

1.2.7小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性和ROS、MDA含量测定实验结束后，各组小鼠眼球采血于离心管中，待凝固后，3000r/min，离心15min，分离血清，采用ELISA试剂盒测定各组小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量，ROS检测采用Fenton反应及Griess试剂显色法测定。

1.2.8 Western blot检测小鼠视网膜组织中Nrf2、Keap-1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白的表达取小鼠视网膜组织于离心管中，加入1mL制备好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法测定总蛋白含量。取等量蛋白质样品上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质后转膜，用5%脱脂奶粉封闭1h，之后加入稀释后的Nrf2、Keap1、LaminB、HO-1、NQO-1、GCL和GAPDH一抗，4℃摇床上孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次10min，加入对应于一抗种属来源的HRP标记的二抗，在室温摇床上孵育1h，用TBST洗膜3次，每次10min。使用ECL化学发光液显色发光，凝胶成像系统拍照，Image Pro Plus图像分析系统对蛋白条带进行分析。

图1各组小鼠眼底照相及OCT检查结果A：各组小鼠眼底照相结果，红色箭头指向黄白色似玻璃膜疣物质；B：各组小鼠OCT检查结果。aP<0.05vs对照组，cP<0.05vs模型组。

计算机直接制版(Computer to Plate)最早是由照相直接制版发展而来的。所有制版设备都是采用计算机控制的激光扫描成像，然后通过显影、定影等工序成印版。这一技术使文字、图像转变成数字，免去了胶片这一中间媒介，减少了中间过程的质量损失和材料消耗。湖北省103个县（市、区）地理国情普查挂图采用计算机直接制版技术(CTP技术)，有一下几点关键技术：

2结果

2.1三组小鼠眼底及视网膜厚度的变化眼底照相结果显示：对照组小鼠眼底未见黄白色似玻璃膜疣物质；模型组小鼠眼底出现大量黄白色似玻璃膜疣物质，说明造模成功；槲皮素组小鼠眼底出现黄白色似玻璃膜疣物质，但较模型组明显减少，见图1A。OCT检查结果显示，对照组、模型组、槲皮素组小鼠视网膜厚度分别为319.23±12.34、234.46±11.23、300.56±12.12μm，差异有统计学意义(F=18.082，P<0.05)。与对照组相比，模型组小鼠视网膜厚度减少(P<0.05)；与模型组相比，槲皮素组小鼠视网膜厚度增加(P<0.05)，见图1B。

2.2槲皮素对小鼠眼底血管完整性的影响FFA结果显示：对照组、模型组、槲皮素组小鼠视网膜血管渗漏点分别为4.34±0.98、28.56±1.45、17.78±1.23个，差异具有统计学意义(F=57.367，P<0.001)。对照组小鼠的视网膜血管无渗漏现象发生，与对照组相比，模型组小鼠的视网膜血管发生渗漏，可以看见明显的渗漏点(P<0.001)；与模型组比较，槲皮素组小鼠视网膜血管发生渗漏，但渗漏点较模型组明显减少(P<0.05)，见图2。

2.3槲皮素对小鼠视网膜电图的影响视网膜电图结果显示：对照组、模型组、槲皮素组小鼠a波振幅、b波振幅差异均具有统计学意义(F=60.547，P<0.001；F=62.645，P<0.001)。与对照组比较，模型组小鼠a波振幅、b波振幅均显著下降(P<0.001)；与模型组比较，槲皮素组小鼠a波振幅、b波振幅均明显上升(P<0.01)，见图3，表1。

2.4槲皮素对小鼠视网膜形态改变的影响HE染色结果显示：对照组小鼠视网膜各层结构清晰，无坏死脱落现象；模型组小鼠视网膜各层结构不清晰，部分发生坏死脱落；槲皮素组小鼠视网膜结构比较清晰，部分外核层发生坏死脱落，见图4。

2.5槲皮素对小鼠血清中ROS、MDA含量的影响Griess试剂显色法结果显示，对照组、模型组、槲皮素组小鼠血清中ROS含量差异具有统计学意义(F=20.563，P<0.01)。与对照组相比，模型组小鼠血清中ROS含量明显增加(P<0.01)；与模型组相比，槲皮素组小鼠血清中ROS含量降低(P<0.05)。ELISA结果显示，对照组、模型组、槲皮素组小鼠血清中MDA含量差异具有统计学意义(F=36.678，P<0.001)。与对照组相比，模型组小鼠血清中MDA含量明显增加(P<0.01)；与模型组相比，槲皮素组小鼠血清中MDA含量降低(P<0.01)，见图5，表2。

图2FFA检查各组小鼠眼底血管完整性bP<0.001vs对照组，cP<0.05vs模型组。

图3各组小鼠视网膜a波和b波振幅结果bP<0.001vs对照组，dP<0.01vs模型组。

图4HE染色观察各组小鼠视网膜形态的改变(×100)A:对照组；B：模型组；C：槲皮素组。

组别na波b波对照组2098.34±1.87138.23±2.02模型组1918.56±1.01b43.67±1.45b槲皮素组2064.21±1.12d108.98±1.56d

注：bP<0.001vs对照组，dP<0.01vs模型组。

2.6槲皮素对小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性的影响ELISA结果显示，对照组、模型组、槲皮素组小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性差异具有统计学意义(F=20.457，P<0.01；F=59.487，P<0.001；F=57.452，P<0.001)。与对照组相比，模型组小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性均明显下降(P<0.01)；与模型组相比，槲皮素组小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性提高(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，见图6和表3。

组别nROS(荧光强度)MDA(nmol/mL)对照组201502.56±28.5413.45±0.78模型组194001.75±35.67b29.78±0.99b槲皮素组202453.67±29.78c19.87±0.86d

注：bP<0.01与对照组；cP<0.05，dP<0.01vs模型组。

2.7槲皮素对小鼠视网膜中Nrf2蛋白表达的影响Western blot结果表明，对照组、模型组、槲皮素组小鼠视网膜中Nrf2蛋白表达差异均具有统计学意义(F=56.023，P<0.001；F=58.459，P<0.001)。与对照组相比，模型组小鼠视网膜细胞质中Nrf2蛋白表达下调(P<0.001)，细胞核中Nrf2蛋白表达上调(P<0.001)；与模型组相比，槲皮素组小鼠视网膜细胞质中Nrf2蛋白表达上调(P<0.05)，细胞核中Nrf2蛋白表达下调(P<0.05)，见图7和表4。

图5各组小鼠血清中ROS、MDA含量的变化A：ROS；B：MDA。bP<0.01vs对照组；cP<0.05，dP<0.01vs模型组。

图6ELISA检测各组小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性的表达A: SOD； B: GSH-Px； C:CAT。bP<0.01vs对照组；cP<0.05，dP<0.01vs模型组。

图7Western blot 检测各组小鼠视网膜中Nrf2蛋白表达情况A、C：各组小鼠视网膜细胞质中Nrf2蛋白表达情况；B、D：各组小鼠视网膜细胞核中Nrf2蛋白表达情况。bP<0.001vs对照组，cP<0.05vs模型组。

组别nSODGSH-PxCAT对照组2037.89±1.76112.56±1.3412.38±1.25模型组1919.04±1.45b53.67±0.89b5.97±1.02b槲皮素组2031.56±1.23c78.96±0.79d8.65±1.03c

注：bP<0.01vs对照组；cP<0.05，dP<0.01vs模型组。

组别nNrf2/GAPDHNrf2/LaminB对照组200.61±0.130.53±0.09模型组190.28±0.07b0.79±0.07b槲皮素组200.43±0.06c0.63±0.05c

注：bP<0.001vs对照组，cP<0.05vs模型组。

2.8槲皮素对小鼠视网膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达的影响Western blot结果表明，对照组、模型组、槲皮素组小鼠视网膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达差异均具有统计学意义(F=26.621，P<0.01；F=30.421，P<0.01；F=46.785，P<0.001；F=40.123，P<0.001)。与对照组相比，模型组小鼠视网膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达均上调(P<0.01)；与模型组相比，槲皮素组小鼠视网膜中Keap1、NQO-1、GCL蛋白表达均下调(P<0.05，P<0.001，P<0.01)，见图8和表5。

3讨论

ARMD是一种复杂的神经退行性疾病，导致老年人视力丧失。ARMD的发展是基于年龄相关的视网膜色素上皮细胞(RPE)和脉络膜毛细血管的变化，但是从典型的年龄相关变化向病理过程的转变的确切机制仍然知之甚少。ARMD的特征在于神经元和光感受器的进展性丧失，从而导致失明。视网膜细胞死亡受复杂机制控制，目前尚不清楚。这种状况阻碍了ARMD有效治疗的发展[9]。

图8Western blot 检测各组小鼠视网膜中Keap-1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达情况bP<0.01vs对照组；cP<0.05，dP<0.01vs模型组。

组别nKeap-1/GAPDHHO-1/GAPDHNQO-1/GAPDHGCL/GAPDH对照组200.29±0.130.45±0.170.25±0.120.19±0.06模型组190.56±0.14b0.75±0.14b0.58±0.13b0.40±0.09b槲皮素组200.36±0.98c0.61±0.160.32±0.08d0.27±0.07d

注：bP<0.01vs对照组；cP<0.05，dP<0.01vs模型组。

研究表明，Nrf2/Keap1/ARE信号通路是细胞中抗氧化应激重要的信号通路。研究发现，在正常情况下，Nrf2和Keap1结合在一起并存在于细胞质中。当受到氧化应激时，这种稳态状态被打破，Nrf2和Keap1形成的二聚体被打破，Nrf2和Keap1分离，Nrf2迅速从细胞浆进入到细胞核，与ARE结合，启动其下游靶基因，调节SOD、GSH-Px、CAT、HO-1、NQO-1、GCL等的转录活性[10]。其中这些酶可降低血清中MDA含量，清除细胞内ROS，从而发挥抗氧化作用，减轻氧化损伤，降低机体内氧化应激状态[11]。氧化应激能导致视网膜功能障碍和变性，与ARMD相关，减轻氧化应激是认为治疗视网膜疾病有效的方法。

槲皮素又名槲皮黄素，是一种黄酮类化合物，其以苷的形式存在于大多数植物的花、叶、果实。研究证实，槲皮素具有抗炎、清除自由基、抗氧化、抑制新生血管生成等作用[12]。Xu等[13]研究发现，槲皮素磷脂复合物能使氧化损伤的视网膜色素细胞中Nrf2通路相关蛋白和其下游抗氧化酶及Ⅱ相代谢酶提高，从而发挥抗氧化作用，说明槲皮素对于年龄相关性黄斑变性的治疗具有潜在价值。在本实验室前期的实验中，我们发现槲皮素对年龄相关性黄斑变性有一定的治疗作用，其中当槲皮素的剂量为200mg/kg作用效果最佳，因此，后续实验选择此浓度。

在本实验中，我们先进行了眼底照相，结果显示，与对照组相比，模型组小鼠眼底出现大量黄白色似玻璃膜疣物质且视网膜厚度减少，然而槲皮素可以减少小鼠眼底的黄白色似玻璃膜疣物质减少且增加视网膜厚度，提示造模成功且槲皮素对年龄相关性黄斑变性有一定的治疗作用。OCT实验结果表明，与对照组相比，模型组小鼠的视网膜血管发生明显渗漏，槲皮素组小鼠视网膜血管发生渗漏，但渗漏面积较模型组明显减少。在小鼠视网膜电图中我们发现，与对照组比较，模型组小鼠a波振幅、b波振幅均显著下降，与模型组比较，槲皮素组小鼠a波振幅、b波振幅均明显上升。HE染色结果表明，对照组小鼠视网膜各层结构清晰，无坏死脱落现象，模型组小鼠视网膜各层结构不清晰，部分发生坏死脱落，槲皮素组小鼠视网膜结构比较清晰，部分外核层发生坏死脱落。ELISA实验显示，与对照组相比，模型组小鼠血清中ROS、MDA含量明显增加，SOD、GSH-Px、CAT活性明显下降，与模型组相比，槲皮素组小鼠血清中ROS、MDA含量降低，SOD、GSH-Px、CAT活性提高，提示槲皮素可以减轻氧化应激反应，对年龄相关性黄斑变性有保护作用。进一步探讨了槲皮素对Nrf2/Keap1/ARE信号途径的作用，结果表明，与对照组相比，模型组小鼠视网膜细胞质中Nrf2蛋白表达下调，细胞核中Nrf2蛋白表达上调，与模型组相比，槲皮素组小鼠视网膜细胞质中Nrf2蛋白表达上调，细胞核中Nrf2蛋白表达下调。与对照组相比，模型组小鼠视网膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达上调，与模型组相比，槲皮素组小鼠视网膜中Keap1、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达下调。因此，槲皮素通过Nrf2/Keap1/ARE通路对年龄相关性黄斑变性具有保护作用。

综上所述，槲皮素通过Nrf2/Keap1/ARE通路，改善视网膜光损伤后的氧化应激状态，保护视网膜功能，对年龄相关性黄斑变性具有保护作用。因此，槲皮素在年龄相关性黄斑变性的治疗和预后方面带来新的应用。