连翘酯苷A对溃疡性结肠炎模型大鼠免疫功能的影响*

余 亮，江惠丽，刘豪杰

（湖北省鄂州市中心医院消化内科，湖北鄂州436000）

溃疡性结肠炎是一种病因不明的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病变主要累及大肠黏膜及黏膜下层，其病程漫长，常反复发作，临床治疗较为困难[1-2]。目前多认为免疫因素在溃疡性结肠炎发生、发展中起重要作用，免疫干预治疗有显著的临床效果[3-4]。

连翘酯苷A（forsythiaside A，FA）是从木犀科植物连翘的干燥果实中提取的中药单体，具有抗氧化、抗病毒、抗炎及免疫调节等多种生物功能[5]。研究表明[6-7]，连翘酯苷A用于治疗内毒素血症小鼠具有显著的免疫调节能力，并对内毒素诱导的炎症反应起到抑制作用，表现出显著的抗炎和免疫调节作用。然而，连翘酯苷A在溃疡性结肠炎中的治疗效果尚未见报道。T淋巴细胞是机体免疫反应的核心环节，其中CD3+、CD4+和CD8+各亚群细胞间比例失调可导致免疫反应紊乱，进而造成炎症活动或组织损伤，这是溃疡性结肠炎发病及进展的重要机制之一[8]。此外免疫球蛋白和补体水平可反应机体免疫应答能力。本研究通过建立溃疡性结肠炎模型大鼠，从T淋巴细胞亚群、免疫球蛋白、补体等不同方面的免疫功能变化探讨连翘酯苷A对溃疡性结肠炎大鼠免疫功能的影响及其相关机制。

材料和方法

1 动物

60只健康清洁级SD大鼠，雌雄不限，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2012-0001。饲养环境为温度（21±2）℃，相对湿度30%～70%，光照周期12 h/12 h。

2 主要试剂

连翘酯苷A（上海士锋生物生物科技有限公司，批号L28-120624）；2，4-二硝基氯苯（北京兴福精细化学研究所，批号20070717）；戊巴比妥钠（上海生化试剂三厂，批号84-06-12）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）和IL-4 ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；抗CD3、CD4和CD8单克隆抗体（北京同立海源生物科技有限公司）；免疫球蛋白（IgA和IgG）检测试剂盒（中山标佳生物科技有限公司）。

3 方法

3.1 溃疡性结肠炎大鼠模型的建立 60只SD大鼠适应性饲养7 d后，随机分为对照组（control）和模型组（model）。模型组48只大鼠颈背部剃毛后，经颈背部滴注2%的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液，每天1次，1次5滴，连续滴注14 d；然后向肛内约6 cm处结肠腔内灌注1%的2，4-二硝基氯苯乙醇溶液，每次0.35 mL，每天1次，连续灌注4 d。对照组12只大鼠给予相应药物溶剂处理，饮食且与模型组相同。模型组大鼠造模后1 d出现不同程度饮食减少、体质量减轻、精神萎靡、有脓血黑便、肛周及会阴部潮湿等溃疡性结肠炎的表现。随机处死对照组和模型组各2只，取结肠标本进行病理检查，以确认造模成功。

3.2 实验分组和给药 于造模结束后第2天，将模型组大鼠随机分为4组，即模型组及连翘酯苷A低剂量（low dose of FA，FA-L）、中剂量（middle dose of FA，FA-M）和高剂量（high dose of FA，FA-H）组，每组12只。采用灌胃给药方式，连翘酯苷A低、中、高剂量组分别给予5 mg/kg、20 mg/kg和80 mg/kg连翘酯苷A，连续7 d。对照组和模型组给予等体积生理盐水。

3.3 样本采集 连翘酯苷A给药结束后第2天，各组大鼠称重后，给予3%戊巴比妥钠麻醉，股静脉取血3 mL加入EDTA-K2抗凝管中，分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）；另取3 mL于EDTA-K2抗凝管中，3 000 r/min离心20 min收集上层血清，保存于-20℃中。采血后，脱颈椎法处死大鼠，取病变结肠组织，用0.85%氯化钠冲洗后进行组织匀浆，保存于-80℃。另取大鼠脾脏和胸腺，除尽脂肪等组织后，称取湿重，计算脾脏指数和胸腺指数。脾脏（或胸腺）指数=脾脏（或胸腺）湿重/大鼠体重×100。

3.4 指标检测 （1）取大鼠结肠组织匀浆，采用硫代巴比妥酸反应产物比色法检测组织中MDA含量，采用氮蓝四唑显色法检测组织中SOD活性。（2）取大鼠PBMC悬液，流式细胞术检测CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞占总T淋巴细胞百分比，并计算CD4+/CD8+比值；采用全自动特定蛋白分析仪（Beckman Coulter IMMAGE 800，免疫比浊法）检测血清中的IgA和IgG水平；采用全自动化学发光免疫分析系统（Beckman Coulter UniCel Dxl 800）及其配套试剂检测血清补体C3和C4水平。（3）取大鼠血清，ELISA检测血清中TNF-α、IL-2和IL-4的含量。

4 统计学处理

应用统计学软件SPSS 19.0分析实验数据，计量资料用均数±标准差（mean±SD），两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 连翘酯苷A对各组大鼠结肠病理损伤的影响

对照组大鼠结肠黏膜固有层无炎症细胞浸润，隐窝无坏死，上皮结构完整；与对照组比较，模型组大鼠结肠黏膜固有层伴淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润，多数黏膜层出现隐窝脓肿、隐窝炎，表面无上皮覆盖，结构紊乱，形成溃疡、萎缩等，提示造模成功；与模型组比较，连翘酯苷A各剂量组大鼠结肠组织上述病变明显减轻，黏膜可见再生的黏膜上皮及腺体覆盖，其中高剂量组效果最好，可见黏膜溃疡基本痊愈，见图1。

Figure 1.The effect of FA on the pathological changs of the colon tissues in each group（HE staining，×200）.图1 连翘酯苷A对各组大鼠结肠病理损伤的影响

2 连翘酯苷A对各组大鼠免疫器官指数及结肠组织中MDA含量和SOD活性的影响

与对照组比较，模型组大鼠脾脏指数和胸腺指数降低，结肠组织中MDA含量升高，SOD活性降低（P＜0.05）；与模型组比较，连翘酯苷A各剂量组大鼠脾脏指数和胸腺指数呈剂量依赖性升高，结肠组织中MDA含量降低，SOD活性增强（P＜0.05），见表1。

表1 连翘酯苷A对各组大鼠免疫器官指数及结肠组织中MDA含量和SOD活性的影响Table 1.The effect of FA on immune organ indexes and MDA content and SOD activity in the colon tissues of each group（Mean±SD.n=12）

3 连翘酯苷A对各组大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞水平均降低（P＜0.05），CD4+/CD8+比值降低（P＜0.05）；与模型组比较，连翘酯苷A各剂量组大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+细胞的水平及CD4+/CD8+比值呈剂量依赖性升高（P＜0.05），见表2。

表2 连翘酯苷A对各组大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞水平的影响Table 2.The effect of FA on the levels of CD3+，CD4+and CD8+T-lymphocytes in PBMC of rats in each group（Mean±SD.n=12）

4 连翘酯苷A对各组大鼠血清中IgA、IgG、C3和C4水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清中IgA和IgG水平升高，C3和C4水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，连翘酯苷A各剂量组大鼠血清中IgA和IgG水平呈剂量依赖性降低（P＜0.05），C3和C4水平升高。见表3。

表3 连翘酯苷A对各组大鼠血清中IgA、IgG、C3和C4水平的影响Table 3.The effect of FA on serum levels of IgA，IgG，C3 and C4 in the rats（U/L.Mean±SD.n=12）

5 连翘酯苷A对各组大鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-4含量的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清中TNF-α和IL-2含量升高（P＜0.05），IL-4含量降低（P＜0.05）；与模型组比较，连翘酯苷A各剂量组大鼠血清中TNF-α和IL-2含量呈剂量依赖性降低（P＜0.05），IL-4含量呈剂量依赖性升高（P＜0.05），见表4。

表4 连翘酯苷A对各组大鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-4含量的影响Table 4.The effect of FA on the serum levels of TNF-α，IL-2 and IL-4 in the rats（ng/L.Mean±SD.n=12）

讨 论

溃疡性结肠炎的发病机制尚未完全阐明，目前认为在遗传基因基础上，外源性物质感染肠道引起的异常免疫反应是导致结肠炎性病变的重要原因[9]。本研究采用2，4-二硝基氯苯丙酮和 2，4-二硝基氯苯乙醇溶液建立溃疡性结肠炎大鼠模型，发现连翘酯苷A能有效减轻结肠病变程度。脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官。已有研究表明，溃疡性结肠炎大鼠脾脏指数和胸腺指数明显降低，器官免疫能力降低[10]。本研究中模型组大鼠的脾脏指数和胸腺指数降低，与文献报道一致；而经连翘酯苷A处理后大鼠脾脏指数和胸腺指数明显升高，提示连翘酯苷A能够促进溃疡性结肠炎模型大鼠的脾脏和胸腺发育，具有免疫调节作用，且以高剂量效果最好。

机体氧自由基过多作用于脂质发生过氧化反应，产生的过氧化产物MDA使蛋白质变性、交联，而损伤DNA，使酶、激素失活进而损伤细胞及细胞膜，是溃疡性结肠炎病情进展的重要因素之一[11-12]。本研究结果显示，模型组大鼠结肠组织中MDA含量增加，SOD活性减弱，经连翘酯苷A处理后大鼠结肠组织中MDA含量减少，SOD活性增强，提示连翘酯苷A能有效增强大鼠抗氧化能力从而抑制结肠组织中脂质过氧化反应，减轻结肠黏膜损伤。此外。氧化应激产生过量氧自由基可刺激免疫细胞，使免疫细胞功能降低，进而影响机体免疫系统功能[13]。T淋巴细胞是细胞免疫反应的重要组成部分，外周血T细胞亚群中CD4+细胞具有协助B细胞分泌抗体和调节其他T细胞免疫应答的作用，而CD8+细胞则是主要的细胞毒效应细胞[14]。本研究结果显示，溃疡性结肠炎大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值降低，说明溃疡性结肠炎大鼠机体识别和杀伤毒性细胞的能力下降，细胞免疫功能处于免疫抑制状态造成机体免疫能力下降；而经连翘酯苷A处理后，CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值明显升高，大鼠免疫能力逐渐恢复，提示连翘酯苷A能够调节T淋巴细胞亚群比例而调节溃疡性结肠炎大鼠免疫功能，其作用可能与增强大鼠抗氧化能力有关。

免疫球蛋白是机体免疫防御机制的另一重要组成部分。王艳等[15]报道，溃疡性结肠炎患者血清免疫球蛋白异常变化与患者疾病活动度和体液免疫紊乱显著相关。但目前对溃疡性结肠炎血清免疫球蛋白变化的研究结论尚不统一。有报道指出，溃疡性结肠炎患者血清IgG、IgA和IgM及补体C3和C4水平无明显变化[16]；也有报道表明，溃疡性结肠炎血清IgM水平无明显变化，而IgG和IgA水平明显升高[17-18]。本研究结果显示，溃疡性结肠炎大鼠血清中IgA和IgG水平升高，补体C3和C4水平降低。免疫球蛋白属于体液免疫，IgA和IgG水平升高提示溃疡性结肠炎大鼠体液免疫亢进，可能是对细胞免疫功能降低的代偿作用。C3和C4是补体系统的重要分子，在补体活化产生膜攻击复合物中起重要作用，其水平降低导致机体吞噬作用受限制、血管通透性下降、细胞溶解作用下降等，使机体免疫力降低[19]。在本研究中，经连翘酯苷A处理后，大鼠血清IgA和IgG水平降低，补体C3和C4水平升高，提示连翘酯苷A对溃疡性结肠炎大鼠免疫功能具有改善作用。

研究表明，抗炎和促炎因子分泌失衡是溃疡性结肠炎患者肠道炎性病变的重要环节，促炎因子TNF-α和IL-2水平升高参与细胞免疫和促进肠道炎性反应，可造成肠道组织进一步损伤[20-21]。此外机体清除氧自由基能力降低也是促进炎症发生的重要因素。IL-4是重要的抗炎因子，可以通过抑制TNF-α和IL-2及其它炎性因子产生、抑制巨噬细胞和淋巴细胞产生和移动、增强SOD活性等来维持肠道免疫功能[22]。本研究结果显示，溃疡性结肠炎大鼠血清中TNF-α和IL-2含量升高，IL-4含量降低，而经连翘酯苷A处理后血清TNF-α和IL-2含量明显降低，IL-4含量明显升高，提示连翘酯苷A可能通过促进溃疡性结肠炎大鼠IL-4分泌，抑制促炎因子，维持肠道免疫稳态，从而减缓病情发展。

综上所述，连翘酯苷A能够增强溃疡性结肠炎大鼠机体氧自由基清除能力，抑制炎症反应，增强机体免疫功能，有效减轻结肠病变。本研究为连翘酯苷A在溃疡性结肠炎临床治疗中的应用提供了实验和理论依据。