桑寄生提取物联合miR-375对骨关节炎软骨细胞活力和凋亡的影响*

卓泽铭，范忠诚，郭 祥

（中南大学湘雅医学院附属海口医院骨科，海南海口570208）

骨关节炎是一种以关节软骨退化、滑膜炎症、软骨下骨增厚和骨赘形成为特征的慢性退行性关节疾病，是与关节创伤和衰老相关的最常见的关节疾病[1]。目前，骨关节炎药物治疗方案仍然有限，非药物治疗方案亦未得到充分利用[2]。因此，迫切需要扩大研究，以便更充分地探索基于骨关节炎机制的疼痛管理策略。桑寄生（Herba Taxilli，Sangjisheng，SJS）是桑寄生科植物桑寄生[Taxillus chinensis（DC.）Danser]的干燥带叶茎枝，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎元的功能，用于风湿痹痛、腰膝酸软、筋骨无力、崩漏经多、妊娠漏血、胎动不安、头晕目眩等[3]。研究发现，桑寄生水提物具有良好的抗炎活性[4]，桑寄生总黄酮对佐剂性关节炎大鼠足趾肿胀程度及全身症状具有明显改善作用，显现出明显的祛风湿作用[5]。但桑寄生对骨关节炎软骨细胞生物行为的影响及其机制目前还少有研究。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类高度保守的内源性非编码RNA，参与骨关节炎发生发展过程[6]。有研究对膝骨关节炎患者软骨组织miRNA表达进行检测，发现miR-375在骨关节炎软骨组织中高表达[7]，并发现miR-375在病变组软骨祖细胞中表达上调[8]。miR-375对骨关节炎的影响目前尚不明确。基于此，本研究体外培养人原代骨性关节软骨细胞RPOC，观察桑寄生提取物对白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）诱导的骨关节炎软骨细胞生长和凋亡的影响，并结合miR-375对其潜在的作用机制进行初步探索。

材料和方法

1 主要试剂

桑寄生购自中南大学湘雅医学院附属海口医院；IL-1β和MTT购自Sigma-Aldrich；DMEM培养基购自Gibco；RIPA裂解液购自Solarbio；抗细胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗体、抗P21抗体、抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体、抗caspase-3抗体和抗GAPDH抗体购自Cellular Signaling Technology；辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗购自北京中杉金桥公司；异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶（annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，annexin Ⅴ-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司；Trizol和Lipofectamine 2000购自Invitrogen；实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）相关检测试剂盒购自TaKaRa；anti-miR-375、miR-375及各自阴性对照购自GenePharma。

2 方法

2.1 桑寄生提取物的制备 桑寄生提取物的制备参照管俊[9]的方法进行，即桑寄生药材粉末用70%的乙醇以1∶20的料液比，在80℃条件下提取1.5 h，重复2次。合并2次滤液，浓缩干燥即得桑寄生提取物。

2.2 细胞分离、培养与分组 收集本院因下肢损毁性创伤（无骨关节炎病史）而进行全膝关节置换手术的废弃组织标本，并经患者或其家属的知情同意，参照张庆等[10]的方法进行人原代骨性关节软骨细胞RPOC的分离。对RPOC鉴定后发现，与文献[10]所述一致，即细胞形态多呈圆形、椭圆形或短梭形，含丰富的胞浆，圆形胞核，核仁1～3个，呈“笑脸状”，散状生长，部分细胞融合生长。将分离的RPOC置于含20%胎牛血清的DMEM培养基中培养。将第2代生长状态良好的RPOC分为对照组（control组，细胞不用IL-1β处理），模型组（IL-1β组，10 μg/L IL-1β处理细胞[11]），SJS低剂量给药组（IL-1β+SJS-L组，10 μg/L IL-1β和0.09 g/L桑寄生提取物处理细胞），SJS中剂量给药组（IL-1β+SJS-M组，10 μg/L IL-1β和0.18 g/L桑寄生提取物处理细胞），高剂量给药组（IL-1β+SJSH组，10 μg/L IL-1β和0.36 g/L桑寄生提取物处理细胞）。

2.3 MTT法检测细胞活力 将RPOC密度调整为1×107/L，并接种于96孔板，培养24 h、48 h和72 h后加入MTT溶液100 μL，37℃反应4 h，加入二甲基亚砜200 μL，37℃剧烈振荡培养10 min，于酶标仪检测RPOC 490 nm下的吸光度（A）值。

2.4 Western blot检测 cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表达 利用RIPA裂解液提取RPOC中总蛋白，进行10%SDS-PAGE，转膜，室温下用5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，加入1∶1 000稀释的抗cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3抗体，4℃孵育过夜。次日，TBST充分洗涤，加入II抗，孵育2 h，化学发光液显色显影，以GAPDH作为内参照，分析cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞凋亡的检测参照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行操作。收集RPOC 5×105个，悬浮后依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀后室温避光反应15 min，进行流式细胞仪的检测。

2.6 qPCR检测miR-375的表达 利用Trizol试剂提取RPOC总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，进行qPCR反应。miR-375的正向引物序列为5'-GGCTCTAGAGGGGACGAAGC-3'，反向引物序列为 5'-GGCAAGCTTTTTCCACACCTCAGCCTTG-3'；内参照U6的正向引物序列为5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列为5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。 通 过 2-ΔΔCt法计算miR-375表达。

2.7 细胞转染实验 转染前24 h，将RPOC接种于6孔板。待细胞密度达约70%，利用Lipofectamine 2000试剂在细胞中转染anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC和miR-375。其中，转染anti-miR-NC、antimiR-375的细胞使用10 μg/L IL-1β进行处理，转染miR-NC、miR-375的细胞使用10 μg/L IL-1β和0.36 g/L桑寄生提取物处理。收集转染48 h的细胞，按照上述方法检测细胞活力、凋亡、miR-375、cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表达。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，结果表示为均数±标准差（mean±SD）。两组间数据的比较采用t检验，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 桑寄生对IL-1β作用的RPOC活力的影响

MTT检测结果显示，与control组比较，IL-1β组24 h、48 h和72 h的RPOC活力明显降低（P＜0.05）；与IL-1β组比较，IL-1β+SJS-L组在24 h、48 h和72 h的RPOC细胞活力无显著变化，IL-1β+SJS-M组和IL-1β+SJS-H组在24 h、48 h和72 h的RPOC细胞活力较IL-1β组显著升高（P＜0.05），见表1。因此选用作用较为明显的桑寄生提取物浓度0.36 g/L即SJS-H做后续实验。

Western blot检测结果发现，与control组比较，IL-1β组RPOC中cyclin D1的表达量明显减少，P21的表达量显著增加（P＜0.05）；与IL-1β组比较，IL-1β+SJS-L组RPOC中cyclin D1和P21蛋白水平无明显变化，IL-1β+SJS-M组和IL-1β+SJS-H组cyclin D1的表达量显著增加，P21的蛋白水平明显降低（P＜0.05），见图1、表1。

Figure 1.The effect of SJS on the expression of proliferation related-proteins in RPOC treated with IL-1β.图1 桑寄生对IL-1β作用的RPOC增殖相关蛋白表达的影响

表1 桑寄生对IL-1β作用下的RPOC中cyclin D1和P21蛋白表达及细胞活力的影响Table 1.Effects of SJS on cyclin D1 and p21 protein expression and cell viability of RPOC stimulated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

2 桑寄生对IL-1β作用的RPOC凋亡的影响

流式细胞术检测结果表明，与control组比较，IL-1β组RPOC的凋亡率明显增加（P＜0.05）；与IL-1β组比较，IL-1β+SJS-H组RPOC的凋亡率显著降低（P＜0.05），见图2A、表2。Western blot检测结果显示，与control组比较，IL-1β组RPOC的Bcl-2蛋白表达量明显减少，Bax和caspase-3蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与IL-1β组比较，IL-1β+SJS-H组RPOC的Bcl-2蛋白表达量明显增加，Bax和caspase-3蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图2B、表2。

Figure 2.The effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β.A：the images of flow cytometry for analyzing the effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β；B：the images of Western blot for determining the effect of SJS on the expression of apoptotic proteins in the RPOC treated with IL-1β.图2 桑寄生对IL-1β作用的RPOC凋亡的影响

表2 桑寄生对IL-1β作用的RPOC中miR-375表达水平和凋亡的影响Table 2.The effect of SJS on miR-375 expression and apoptosis of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

3 桑寄生对IL-1β作用的RPOC中miR-375表达的影响

qPCR数据显示，与control组比较，IL-1β组RPOC中miR-375的表达量明显增加（P＜0.05）；与IL-1β组比较，IL-1β+SJS-H组RPOC内miR-375的表达量显著减少（P＜0.05），见表2。

4 抑制miR-375对IL-1β作用的RPOC活力、增殖相关蛋白表达和凋亡的影响

与IL-1β+anti-miR-NC组比较，IL-1β+anti-miR-375组RPOC中miR-375表达量明显减少（P＜0.05），cyclin D1和Bcl-2蛋白水平显著升高，而P21、Bax和caspase-3蛋白的水平明显减少（P＜0.05），24 h、48 h和72 h的细胞活力明显升高（P＜0.05），并且细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），见图3及表3～4。

Figure 3.The effect of miR-375 on the apoptosis of the RPOC and the expression of cyclin D1，P21 and apoptosis-related proteins in the RPOC.A：effect of anti-miR-375 on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β；B：effect of anti-miR-375 on the protein levels of cyclin D1，P21 and apoptosis-related proteins in the RPOC treated with IL-1β.图3 抑制miR-375对IL-1β作用的RPOC凋亡及其中cyclin D1、P21和凋亡相关蛋白表达的影响

表3 抑制miR-375对IL-1β作用的RPOC活力及增殖相关蛋白表达的影响Table 3.The effect of anti-miR-375 on the viability and prroliferation-related protein expression of RPOC treated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

表4 抑制miR-375对IL-1β作用的RPOC凋亡的影响Table 4.Inhibitory effect of anti-miR-375 on the apoptosis of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

5 过表达miR-375能逆转桑寄生对IL-1β作用的RPOC活力和增殖相关蛋白表达的影响

与IL-1β组比较，IL-1β+SJS-H组RPOC中miR-375和P21的表达量明显减少，cyclin D1蛋白水平及24 h、48 h和72 h的细胞活力显著升高（P＜0.05）；与IL-1β+SJS-H+miR-NC组比较，IL-1β+SJS-H+miR-375组miR-375和P21的表达量明显增加，cyclin D1蛋白水平及24 h、48 h和72 h的细胞活力显著降低（P＜0.05），见图4、表5。

6 过表达miR-375能逆转桑寄生对IL-1β作用的RPOC凋亡的作用

与IL-1β组比较，IL-1β+SJS-H组RPOC中Bax和caspase-3的蛋白水平及凋亡率明显减少，Bcl-2蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与IL-1β+SJS-H+miR-NC组比较，IL-1β+SJS-H+miR-375组RPOC中Bax和cas

pase-3的蛋白水平及凋亡率明显增加，Bcl-2蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图5、表6。

Figure 4.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the expression of cyclin D1 and P21 in the RPOC treated with IL-1β.图4 过表达miR-375能逆转桑寄生对IL-1β作用的RPOC中cyclin D1和P21蛋白表达的影响

表5 过表达miR-375能逆转桑寄生对IL-1β作用的RPOC活力的作用Table 5.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the viability of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

讨 论

Figure 5.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the apoptosis of and the protein levels of apoptotic molecules in RPOC stimulated with IL-1β.图5 过表达miR-375能逆转桑寄生对IL-1β作用的RPOC凋亡及凋亡蛋白水平的影响

骨关节炎是一种慢性退行性疾病[12]，与年龄、性别和遗传因素相关的代谢和炎症因子通过破坏关节软骨，进而导致骨关节炎。目前已确定多种导致骨关节炎进展的因素，包括参与骨关节炎发病机制的蛋白水解酶和炎性细胞因子[13]。在骨关节炎进展中，促炎细胞因子IL-1β通过刺激软骨退化和触发滑膜炎症发挥关键的作用[14]。IL-1β作用于软骨细胞后，导致软骨细胞活力的降低和细胞凋亡的增加[15]。本研究采用IL-1β处理人原代骨性关节软骨细胞RPOC，构建骨关节炎模型，结果发现，与对照组的RPOC比较，IL-1β处理明显降低24 h、48 h和72 h的细胞活力及cyclin D1、Bcl-2蛋白表达，并提高细胞凋亡率及P21、Bax和caspase-3的蛋白水平，与前人结果相符。本研究还对桑寄生作用于IL-1β处理的RPOC影响上述指标的机制进行了探索。

桑寄生是我国传统中药，含有黄酮类、挥发油类、维生素等化学成分，现代药理研究表明，桑寄生具有抗炎、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖和抗氧化等活性[16]。研究表明，桑寄生浸膏对二甲苯刺激的小鼠耳肿胀具有明显的缓解作用，并加速消退，效果与阿司匹林相当[17]。由桑寄生、熟地等药材制成的熟地寄生壮骨方具有显著的抗炎作用，可以有效改善大鼠膝关节肿胀度，并抑制IL-1和IL-6水平[18]。本研究中，IL-1β抑制RPOC增殖并诱导凋亡，而使用桑寄生提取物后，IL-1β作用的软骨细胞RPOC的活力和凋亡情况与IL-1β组相反，即桑寄生提取物显著提高细胞活力、cyclin D1、Bcl-2蛋白表达，降低细胞凋亡率、P21、Bax、caspase-3蛋白的水平（P＜0.05），显示出对IL-1β诱导的软骨细胞的保护作用。

本实验的qPCR数据显示，IL-1β使RPOC中miR-375表达量明显增加，而加入桑寄生提取物后，miR-375表达量显著减少，提示桑寄生保护IL-1β刺激的软骨细胞与可能调控miR-375表达有关。miRNA是一类由22～25个核苷酸组成的非编码RNA分子，它通过促进降解、抑制翻译或其它机制，成为基因表达的重要转录后调控因子[19]。已有证据表明，miRNA，如miR-34a和miR-181a[20]参与骨关节炎的发生发展过程。miR-375作为一种潜在的肿瘤抑制基因，已被证实在多种人类恶性肿瘤包括乳腺癌[21]、肺腺癌[22]和骨肉瘤[23]中下调。miR-375-3p及其靶点可能作为骨质疏松症诊断的生物标志物，也可能作为骨质疏松症治疗的新型药物[24]。但miR-375对骨关节炎的影响尚未明确。本研究发现抑制miR-375显著减少IL-1β作用的RPOC中miR-375和P21、Bax、caspase-3蛋白的水平及细胞凋亡率，明显提高cyclin D1、Bcl-2蛋白水平、细胞活力。过表达miR-375能逆转桑寄生对IL-1β作用的RPOC活力的促进作用和对细胞凋亡的抑制作用，提示桑寄生促进IL-1β诱导的RPOC生长并抑制其凋亡可能与调控miR-375表达有关。

表6 过表达miR-375能逆转桑寄生对IL-1β作用的RPOC凋亡的作用Table 6.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

总之，桑寄生提取物可以促进IL-1β作用的人原代骨性关节软骨细胞的活力，并抑制细胞凋亡，其作用机制与调控miR-375表达有关。这一结果为骨关节炎的治疗提供了新的线索和潜在的靶点。