荧光PCR探针熔解曲线技术检测MTB耐药性的成本分析

宋怡蒙 李远春 贺文从 何萍 包晶晶 刘春法 刘东鑫 王鑫洋 赵雁林 李燕明

耐药结核病患者的早期、快速、准确诊断是有效治疗的前提，也是结核病防控的关键环节。目前，我国最常用的MTB药品敏感性(简称“药敏”)检测方法为比例法固体药敏法，然而由于MTB生长缓慢，传统药敏试验耗时较长，需要3～8周的时间，很难及时指导临床治疗，亟需一种快速、准确、简单、廉价的药敏试验方法来检测MTB的耐药性[1-2]。

以往研究表明，与分子生物学方法相关的诊断成本过高，可能会成为限制其在基层结核病防治单位推广使用的重要因素[3]。目前尚缺乏有关传统药敏和熔解曲线技术检测成本分析的相关报道。本研究通过对BACTEC MGIT 960技术(简称“MGIT 960”)和荧光PCR探针熔解曲线技术(简称“熔解曲线技术”)进行MTB耐药性检测成本的比较，评估熔解曲线技术在我国不同地区、不同层级结核病专科医院和综合医院进行实验室应用的可行性。

资料和方法

一、研究现场

综合考虑不同医疗机构地域分布情况、医疗机构的性质和级别，选择具有全国代表性的医疗机构联合开展本次研究。最终选取西安、乌鲁木齐、沈阳、南阳、遵义和杭州6个项目地点，以西安市胸科医院、新疆维吾尔自治区胸科医院、沈阳市胸科医院、南阳市第六人民医院、遵义医学院附属医院和杭州市红十字会医院等6家结核病定点医院作为研究现场，于2018年10—12月开展成本数据收集。

二、研究方法

1. MGIT 960：采用美国BD公司生产的BACTEC MGIT 960培养箱、液体培养和药敏试验管进行分析。试剂配制、培养及药敏操作严格遵照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[4]、《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》[5]中的标准化操作程序进行操作。

2. 熔解曲线技术：将1 ml通过2%NaOH溶液处理过的标本应用半自动核酸提取仪(型号：Lab-Aid 824；厦门致善生物科技股份有限公司)提取核酸。根据厦门致善生物科技股份有限公司提供的标准化操作流程配制PCR反应体系，将5 μl提取后的核酸加入20 μl的PCR反应液中进行扩增。对于RFP、INH和二线注射类抗结核药品，分A、B两个体系进行检测，每个体系分别有FAM和TET通道，共4个通道对耐药核心区进行检测。对于氟喹诺酮类药品，采用单个体系一个通道进行耐药性检测。通过比较检测样本与阳性对照之间熔解曲线熔点(Tm)的差异判断是否发生突变。

3. “要素法”成本分析：熔解曲线技术和MGIT 960耐药性检测的成本参考文献[6]，通过要素法进行估算。收集不同检测过程(从实验室接收标本到报告结果和废弃物处理等)所有直接和间接成本，涉及以下几方面要素[7]：(1)基本投入成本：分别收集各实施单位的基本投入成本，包括实验室房屋面积、办公区房屋面积、实验室建设改造费用等，考虑房屋的使用年限，折算房屋单位时间费用；(2)实验室仪器设备成本：所有实验设备的成本均以采购新的价格来计算，且该成本应包括所有的采购相关费用，如运输、安装等；收集主要设备的年度维护/维修成本，根据仪器的使用年限，折算仪器单位时间成本；(3)实验室管理成本：实验室水费、电费、垃圾处理费、暖气费等；(4)人员成本：实验室人员工资，包括支付给员工所有奖金和补助；(5)耗材成本：包括手套、实验服、帽子、常规试剂等耗材单价。

在不同工作量下完成试验的时间，包括人工时间和各种仪器使用时间，因工作量的不同，有些步骤所耗费的时间并非等比例增长。故本次研究中每个实验室根据当地日工作量的不同，分别在日工作量高、中、低的时间记录3次，收集MGIT 960和熔解曲线技术检测过程中的全部时间、仪器使用时间、试剂消耗及耗材数量等情况，如实将各部分情况记入统计表格中，最后取其均值。各要素的成本=试验过程中使用的各要素的数量×各要素的单位价格。其中，资本性费用如实验室空间、建筑物和设备等，其单位价格根据其采购价格和预计的使用年限按照年度折算；管理费用的计算根据实验室工作人员数量、人员工作时间和其他与该系统相关的基础设施、建筑物的使用状况，将相关费用分配到各次检测中。将上述收集的成本数据录入Word中，作为不同实施医院的基础数据。熔解曲线试剂的价格采用项目采购价格，每种药品按照3680元/48人份进行计算，按每次共检测4种药品计算，MGIT 960检测及其他相关耗材的价格采用目前市场调查的价格。

4. 质量控制：收集各项成本数据时，规范各单位3种方法的实验步骤，使其一致；收集熔解曲线技术、MGIT 960检测整个过程所有的直接和间接成本，由双人同时录入Word和Excel中，并经一致性检查修正错误，建立数据库。

5. 统计学处理：采用Word 2013和Excel 2013软件进行数据录入和统计。计数资料采用“率(%)”或“构成比(%)”表示。

结 果

一、MGIT 960检测的平均单位成本

采用MGIT 960技术，对每例患者进行MGIT 960的平均检测成本为702.6元。试剂费、管理费和耗材费的成本占总成本的比例较高，分别占76.5%(537.6/702.6)、8.6%(60.7/702.6)和6.0%(42.1/702.6)，而建筑费和设备费的成本所占比例较低，分别占2.2%(15.2/702.6)和1.4%(9.8/702.6)。在6个项目地点中，乌鲁木齐的成本最高，为734.3元，其耗材费和设备费较其他5个地区高。南阳的成本最低，为643.3元(表1)。

二、熔解曲线技术的平均单位成本

使用熔解曲线技术对每例患者进行MTB耐药性检测的平均单位成本为440.7元。试剂成本占总成本的构成比最高，达到88.8%(391.2/440.7)。管理费、耗材费和人员费成本相似，分别占4.1%(18.2/440.7)、4.1%(18.2/440.7)和2.6%(11.3/440.7)，而建筑费和设备费占比最少，两者相加仅占总成本的0.4%[(0.1+1.7)/440.7]。在6个项目地点中，乌鲁木齐的总成本最高，为447.5元；西安的总成本最低，为433.2元(表2)。使用熔解曲线技术进行MTB耐药性检测的成本较MGIT 960耐药性检测低261.9元。

三、熔解曲线技术与MGIT 960检出1例MDR-TB患者的平均成本

由于各项目点进行耐药MTB检测的单位成本不同，且由于可疑结核病人群中MDR-TB患病率不同及不同检测方法检出率的差异，各地检出1例MDR-TB患者的平均成本也不同。本研究以MGIT 960每人每次检测5种药品耐药情况的成本和熔解曲线技术每人每次检测4种药品耐药情况的成本进行分析，分析使用熔解曲线技术、MGIT 960检出1例MDR-TB患者的平均成本(表3)。本研究采用本次重大专项项目所得出的各地MDR-TB检出率进行计算，使用MGIT 960从MTB培养阳性的患者中检出1例MDR-TB患者的平均成本为5404.6元。其中以南阳的成本最高，为17 869.4元；遵义的成本最低，为4063.8元。使用熔解曲线技术检出1例MDR-TB患者的平均成本为3364.1元，其平均成本低于MGIT 960法。其中以南阳的成本最高，为10 690.2元；沈阳的成本最低，为2259.4元。

表1 MGIT 960耐药性检测的平均单位成本(元)

注采用“要素法”进行成本计算分析；管理费=(月物业费+安保费等管理费用)×试验全部过程所需时间/月法定工作时间/标本例数；建筑费=大楼建设成本×完成该试验实验室面积/大楼面积；设备费=所使用仪器购买价格×用于该试验过程中的使用时间/预期设备使用寿命/标本例数；人员费=实验室人员的月平均工资×完成试验人数×试验全部过程所需时间/月法定工作时间/标本例数；试剂费=试剂单价×试验所用个数/标本例数(或试剂单价×试验用量/试剂总量/标本例数)；耗材费=单价×试验所用个数/标本例数(或单价×试验用量/总数量/标本例数)；各个研究点的单位成本=管理费+建筑费+设备费+人员费+试剂费+耗材费；平均单位成本=各研究点单位成本的总和/研究点数量

表2 熔解曲线技术对MTB耐药性检测的平均单位成本(元)

注采用“要素法”进行成本计算分析；管理费=(月物业费+安保费等管理费用)×试验全部过程所需时间/月法定工作时间/标本例数；建筑费=大楼建设成本×完成该试验实验室面积/大楼面积；设备费=所使用仪器购买价格×用于该试验过程中的使用时间/预期设备使用寿命/标本例数；人员费=实验室人员的月平均工资×完成试验人数×试验全部过程所需时间/月法定工作时间/标本例数；试剂费=试剂单价×试验所用个数/标本例数(或试剂单价×试验用量/试剂总量/标本例数)；耗材费=单价×试验所用个数/标本例数(或单价×试验用量/总数量/标本例数)；各个研究点的单位成本=管理费+建筑费+设备费+人员费+试剂费+耗材费；平均单位成本=各研究点单位成本的总和/研究点数量

表3 不同项目地区分别使用熔解曲线技术和MGIT 960检出1例MDR-TB患者的平均成本

注此表价格为测算数据；单位成本为检测每例患者的平均单位成本(见表1和表2)；检出MDR-TB成本=单位成本/检出率

四、诊断单例MDR-TB患者的费用

MDR-TB的患病率直接影响诊断疾病的成本。同样，诊断方法的敏感度也会影响成本。本研究采用MGIT 960检测结果作为参考标准，分析MGIT 960和熔解曲线技术诊断单例MDR-TB患者的成本。在MDR-TB患病率不同的可疑人群中，不同敏感度的检测方法检出1例MDR-TB患者的平均成本计算方法为：平均成本=平均单位成本/患病率×敏感度。如表4所示，当结核病患者中MDR-TB患病率越高，应用MGIT 960、熔解曲线技术检出1例MDR-TB患者的单位成本越低，而熔解曲线技术成本也随着该方法敏感度的增加而降低。进一步分析可见，以目前各项目地区的检测成本为基础，当熔解曲线技术检出MDR-TB的敏感度高于70%，在结核病人群MDR-TB的患病率≤50%的情况下，使用熔解曲线技术进行耐多药MTB检测的单位成本均低于MGIT 960方法。

讨 论

结核病的检测方法包括病原学、免疫学和分子生物学检测，其中痰涂片方法操作简便、成本较低，但同时其阳性率较低。MTB培养并菌种鉴定仍是目前诊断结核病的金标准，改良罗氏培养和药敏试验一般需要4～8周才能出检测结果，检测周期较长，给临床诊疗带来不便；MGIT 960技术进行培养、药敏试验的时间平均约为2周，相比于改良罗氏培养和药敏试验大大缩短了检测时间，并且其阳性标本检出率也较改良罗氏培养和药敏试验提高10%左右[8-10]。因此，本次研究采用MGIT 960作为参考标准，进行成本的比较分析。随着分子生物学技术的快速发展，MTB分子药敏检测技术近年来发展迅速，其中一些已经发展到根据检测特定的基因突变位点来确定MTB的耐药性[11-12]。基于耐药探针分析的熔解曲线技术是一种具有自主知识产权、敏感度和特异度类似或接近于传统药敏检测技术的耐药MTB检测方法，可用于检测MDR-TB和对部分二线抗结核药品的耐药性。熔解曲线技术用于检测MTB耐药性的性能已获得了良好的验证。检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为92%～98%和96%～100%，检测异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为90%～96%和96%～100%[13-16]。

表4 以MGIT 960检测结果作为参考标准计算熔解曲线技术在不同MDR-TB患病率下检出1例MDR-TB患者的平均成本(元)

注此表价格为测算数据；平均成本=平均单位成本/患病率×敏感度

实验室成本分析是从卫生服务的角度出发，分析与该实验室检测相关的直接和间接的货币成本。本研究基于客观数据分析，采用“要素法”比较了我国6家结核病防治机构实验室将MGIT 960和探针熔解曲线技术用于结核病及MDR-TB诊断的成本。本研究发现，与MGIT 960的平均单位成本比较，使用熔解曲线技术进行MTB检测的平均单位成本较低，较MGIT 960的成本低261.9元。在成本分析过程中不但要考虑试剂、设备及耗材等方面的投入，而且需要将房屋、人力及日常管理等费用按照试验过程中对相关资源的使用状况及时间等分摊到单位检测成本中，由于熔解曲线技术大大缩短了检测的时间，因此使管理、房屋使用、人员、设备耗材等各要素的成本低于MGIT 960。

在本项目评估的条件下，发现熔解曲线技术检测每例患者及MDR-TB患者方面的成本都低于MGIT 960。主要原因考虑为：首先，熔解曲线技术的诊断周期约为2 d，而MGIT 960的周期约为2周，这将导致与时间相关的成本包括管理费、人员费、仪器费等成本上升；其次，熔解曲线技术的试剂成本低于MGIT 960，而试剂费在两者的总成本中均占据较高比例，这导致MGIT 960拥有更高的成本费。不同地区的成本间也呈现出地域差异，其中个别项目点人员工资水平较高，这使得在各分项实验中人员成本明显高于其他地区。此外，各项目点实际情况不同，管理费用差异也较大，实验所用耗材为各个地区项目办采购，因此在耗材方面各个地区实验室之间也表现出一定的差异。

除了较低的成本之外，与传统MGIT 960相比，熔解曲线技术还具有其他优势。首先，熔解曲线技术拥有更短的检测时间，其完成整个检测只需要2.5 h，比传统MGIT 960的2周明显缩短。其次，熔解曲线技术是一种基于核酸检测的方法，具有更好的生物安全性。据一项研究显示，使用传统药敏的实验室人员，感染结核病的风险比使用涂片检查的人员高20倍以上[17]。

本研究也存在很多不足之处，由于客观条件受限，本研究虽然进行了实验技术的成本收集，分析了2种检测技术的相关成本，但是没有考虑到收集检测后改进治疗方法费用或节省的成本，以及检测后所延长的生命年或质量调整生命年等后期效益。因此，本研究的成本-效益分析仍然不够全面。

综合考虑上述因素及成本分析结果，本研究表明，在本研究的采购价格和当前市场价下，熔解曲线技术是一种更具成本-效益的方法，适宜未来在我国市(区、县)级结核病实验室推广使用。