一株裂殖酵母乙酸乙酯发酵条件的优化

武艺

（河北衡水老白干酒业股份有限公司，河北衡水 053000）

乙酸乙酯是一种具有水果香味的挥发性酯，适量的乙酸乙酯可以提高衡水老白干香型白酒的品质，使白酒香气优雅怡人。通过产酯酵母菌液强化大曲，可以提高老白干基酒的优级率，增加经济效益。

白酒生产中常见产酯酵母对乙醇亲和力很强，以乙醇作碳源能发育很好，而且又有较强的氧化性。乙醇能增进产酯酵母的呼吸作用，与酯发酵之间存在特殊关联。产酯酵母具有一定的酒精发酵能力，又具备醋酸发酵能力。在白酒生产中使用最多的产酯酵母是汉逊酵母，其次是球拟酵母和假丝酵母。在白酒生产中添加适量的产酯酵母，增加乙酸乙酯在发酵酒醅中的含量，对增加白酒的风味成分、保证和稳定酒质十分重要[1]。本实验采用菌种由衡水老白干酒大曲中分离筛选获得，其产酸产酯能力较显著。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

葡萄糖(北京陆桥技术股份有限公司)、蛋白胨(安琪公司)为分析纯；酵母粉由安琪公司提供。

1.1.2 主要设备

7890A型气相色谱仪，安捷伦科技有限公司；摇床，太仓实验设备厂；SW-CJ-2FD型超净台，苏州安泰空气技术有限公司；TGL-16型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；0.22 μm微孔滤膜，九鼎高科过滤设备有限公司。

1.1.3 培养基[2]

种子培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%；发酵培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%。

1.2 实验方法[3]

1.2.1 菌种扩大培养

将斜面种子接入种子培养基中，摇床28 ℃培养24 h，摇床转速220 r/min。培养成熟后接入发酵培养基，接种量为5%。

1.2.2 正交实验设计

采用正交试验来探索最优的产酯条件。确定发酵温度（A）、前体乙酸初始酸度（B）、前体起始酒精度（C）3个因素为影响因素[4]。如表1所示，每个因素取3个水平，按L9（34）进行正交试验设计，以乙酸乙酯作为评价指标进行分析。

表1 正交试验因素与水平

1.2.3 乙酸乙酯的测定

吸取发酵液 5 mL，4 000 r/min 条件下离心 10 min，吸取上清液1 mL，稀释后过0.22 μm微孔滤膜后进行色谱检测。每个样品取3个平行样。

2 结果与分析

2.1 发酵条件的优选

正交试验结果见表2和显著性分析见表3。由表2可知，L9（34）正交试验中大部分实验组乙酸乙酯在第5 d达到最大值。由表3可知，以乙酸乙酯为评价指标，各因素对其影响强度为发酵温度＞起始酸度＞起始酒精度，其中因素A、B均显著，且A因素较为显著，C因素不显著。直观分析表明乙酸乙酯浓度最高组合为A2B2C3，即发酵温度28 ℃，起始酸度0.2%，起始酒精度5%。

2.2 验证试验

根据正交实验结果，进行3次实验验证A2B2C3组合，实验结果为 37.90 mg/100 mL 、38.50 mg/100 mL、38.80 mg/100 mL，平均值为 38.40 mg/100 mL。

2.3 后续试验

2.3.1 乙酸乙酯的变化

发酵后期至第6 d后，乙酸乙酯浓度变化加大，规律性紊乱，考虑误差原因，有些样品乙酸乙酯浓度变化在每日50%左右，可能是由于底物浓度变化和挥发或后期分解所致，其变化规律有待进一步研究。

表2 乙酸乙酯发酵条件L9（34）正交试验结果

表3 显著性检验

2.3.2 酒精浓度的影响

发酵后期酒精浓度的显著性有很大提高，个别起始酒精浓度5%的样品达到60 mg/100 mL以上，而起始酒精浓度4%的样品大多徘徊在45 mg/100 mL。

3 结论

通过正交实验，以乙酸乙酯产率为评价指标，各因素对其影响强度为发酵温度＞起始酸度＞起始酒精度，当温度28 ℃、起始酸度0.2%、起始酒精度5%时，所得乙酸乙酯浓度最高，为 37.70 mg/100 mL。

未来考虑将发酵至对数期的发酵液作为增酯强化液泼入酒醅，与酒醅一同发酵，并通过后续实验，不断优化工艺切入点，