微生物絮凝剂ZF-1C的絮凝效果研究

田瑜琳，雒晓芳，朱雅雯，赵梓彤

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学实验教学部，甘肃兰州 730030）

近年来，随着城市化的发展，水环境受到很大程度的影响，存在较为严重的水质污染等问题，城市生态系统遭到严重破坏[1]。这种现象严重威胁了社会的可持续发展和人类的生活生产。

絮凝是当前污水处理过程中十分重要的方法，可以使水或者污水中的悬浮颗粒碰撞聚集，加快粒子沉降，是一种广泛运用的水处理技术。常规絮凝剂通常被分为成三大类，无机絮凝剂、人工合成有机高分子絮凝剂和天然高分子絮凝剂[2]。无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂在处理水的过程中会给水体带来二次污染，天然高分子絮凝剂具有绿色环保无污染等优点。近年来，微生物絮凝剂发展成为一种新兴絮凝剂，这是一类由微生物产生并分泌到细胞外具有絮凝活性的代谢产物构成的絮凝剂，一般由多糖、蛋白质、DNA、纤维素、糖蛋白、聚氨基酸等高分子物质构成，分子中含有多种官能团，能使水中胶体悬浮物相互凝聚、沉淀[3]。微生物絮凝剂以其安全高效、无二次污染、来源范围广、生产周期短以及种类多等特点脱颖而出，被广泛应用于城市污水、印刷污水、屠宰厂污水、煤泥废水等的处理中，成为近年来的研究热点，具有广阔的应用前景。

本次试验针对微生物絮凝剂的产生和絮凝效果进行研究，以雒晓芳等[9]在山东临淄金岭回族镇的污水和淤泥中分离筛选出的志贺氏菌ZF-1作为实验菌株，研究其产生的絮凝剂的絮凝特性，设计不同单因素试验测定絮凝剂的絮凝率，分析不同因素对絮凝效果的影响。

1 实验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源

实验所用菌种为雒晓芳等[9]在山东省临淄区金岭回族镇的水渠中分离得到的有絮凝活性的菌株，经生理生化试验鉴定为志贺氏菌属（Shigella Castellani），并命名为ZF-1，产生的絮凝剂命名为ZF-1C。

1.1.2 实验试剂与仪器

营养肉汤培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸出粉3.0 g/L，氯化钠 5.0 g/L，pH 7.2±0.2，121 ℃高压蒸汽灭菌 30 min。

发酵培养基：0.5 g/L KCl，2.0 g/L NaNO3，0.01 g/L Fe2SO4，1.0 g/L K2HPO4，0.5 g/LMgSO4，30.0 g/L 蔗糖，121 ℃高压蒸气灭菌 30 min，pH 自然。

其他试剂：高岭土、FeCl3、无水CaCl2，所有试剂均为化学纯，由杭州微生物有限责任公司提供。

仪器：YXQ-LS-立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DHG-9140A新型电热恒温鼓风干燥箱，宁波江南仪器厂；干燥箱，宁波江南仪器厂；LRH-150B生化培养箱，ZWY-200D恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；G10SUV-VIS双光束紫外可见分光光度计，Thermo Fisher Scientific有限公司；S.SW-CJ-2F净化工作台，上海跃进医疗器械厂；BA210生物显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 生长曲线的测定

采用李静[10]试验中的比浊法，在660 nm处测定发酵液的浊度（OD660），用所得数据表示絮凝菌株的生长状况，生成的曲线图即可表示絮凝菌的生长状况。

1.2.2 絮凝率的测定

参考姜宇等[11]的絮凝活性测定方法，进行絮凝活性的测定。

1.2.3 絮凝活性的分布

在无菌条件下，用接种环挑取一环提前复壮的ZF-1菌株，接种于营养肉汤培养基，将菌液置于震荡培养箱中于 160 r/min、30 ℃条件下培养 24 h 得到种子培养液。取30 mL种子培养液加入到装有250 mL发酵培养基的锥形瓶中，180 r/min、30 ℃震荡培养48 h。将培养完成的发酵液 4 000 r/min 离心 30 min，所得上清液用于研究产絮凝剂菌株的相关絮凝活性，将沉淀用蒸馏水洗涤两次后加入等体积的蒸馏水吹打混匀得到菌细胞悬液。依照1.2.2的方法，测定发酵液、离心上清液和菌细胞悬液的絮凝率，并比较结果。

1.2.4 絮凝剂的制备

微生物絮凝剂产生菌ZF-1发酵液离心后得到上清液中加入二倍体积的遇冷处理过的己醇，将其混合均匀后在4 ℃冰箱中静置过夜，上清发酵液经过低温下反复的醇提，得到微生物絮凝剂ZF-1C。

1.2.5 絮凝条件的工艺优化

微生物絮凝剂的絮凝效果除受絮凝剂本身的相对分子量、分子结构影响外，还受絮凝剂的投加量和反应体系的温度、pH值、金属离子等影响。故设计多项单因素试验，探究絮凝剂最佳絮凝条件，对其进行工艺优化。

2 结果与分析

2.1 ZF-1培养特征

在实验过程中，为及时了解菌种在培养过程中的生长情况，需定时测定菌体OD660指标及絮凝效果，以便适时控制培养条件，从而获得最佳培养物[12]。

由图1可知，ZF-1菌株在营养肉汤培养基中培养到2 d时达到最高，之后生长曲线开始缓慢下降，可能是因为培养环境中的营养物消耗和代谢物的增加。絮凝率也在第2 d大幅增高，之后增加平缓，因此选取2 d作为发酵培养时间，以节约成本。菌种的絮凝率和生长曲线趋势一致，在ZF-1生长繁殖的同时产生絮凝活性物质。说明絮凝剂的积累伴随着菌体的生长而增长，产絮主要出现在对数生长期，并在稳定期持续产生絮凝活性物质[13]。

图1 ZF-1菌生长曲线及絮凝活性变化曲线

2.2 絮凝活性分布实验

通过对发酵液、发酵上清液以及菌细胞悬液进行高岭土悬浊液的絮凝活性测定，可以知道絮凝剂是菌体本身还是代谢产物。测定结果为图2，分析ZF-1所产絮凝剂分布情况。

由图2可知，发酵后的培养液和发酵后去菌细胞的上凊液絮凝率分别为58.5%和68.81%，菌细胞悬液的絮凝率为3.99%。试验结果表明，ZF-1所产生的微生物絮凝剂是细菌在生长过程中分泌产生的，并不是细菌本身。为进一步提取絮凝剂和实际应用提供了可信的依据[14]。根据以上数据分析，后续实验使用的微生物絮凝剂ZF-1C是从离心上清液中通过低温下反复醇提获取的。

图2 絮凝活性分布

2.3 絮凝剂的热稳定性研究

将微生物絮凝剂在100 ℃水浴中加热15 min、30 min、45 min、60 min、75 min 后分别测定加热后的絮凝活性，测定结果为图3。

由图3可知，ZF-1C有良好的热稳定性，在100 ℃加热60 min的情况下，絮凝率变化幅度小于20%，在加热至75 min时下降了23.38%。以蛋白质为主要成分的微生物絮凝剂活性受温度影响较大，耐热性较差；多糖构成的微生物絮凝剂则不受温度的影响，耐热性好；若为糖蛋白则取决于糖和蛋白质的含量[15]。而ZF-1C在100 ℃加热60 min絮凝活性变化不大，所以判定该絮凝剂是具有热稳定性的多糖。

图3 100 ℃下加热时间对絮凝效果的影响

2.4 絮凝体系pH对絮凝效果的影响

用1% NaOH溶液或1% HCl调节絮凝体系的pH。测定结果如图4所示。

图4 絮凝体系pH值对絮凝效果的影响

pH值能通过改变酸碱度来改变絮凝剂大分子和胶体颗粒的表面电荷、带电状态、中和电荷能力，从而改变颗粒之间的相互作用力，对架桥的形成产生影响[16]。由图4可知，在pH为3和7时，絮凝率达到60%以上，这是因为在酸性条件下，给絮凝剂与悬浮颗粒之间提供了创造架桥氢键的氢离子，絮凝剂大分子通过氢键与多个胶体颗粒结合，形成较大的颗粒团块沉淀下来[17]。在实际运用中，酸性环境会对水体造成二次污染且经济成本较高，故pH为7可达到最佳絮凝效果。

2.5 絮凝剂投加量对絮凝效果的影响

由图5可知，促进絮凝的最佳絮凝剂添加量为4 mL/L。絮凝剂投加量增加至5 mL/L时絮凝活性降低，这是因为过多带负电的絮凝剂存在，使高凝土悬着液颗粒间的静电斥力和竞争吸附力加强，反而不利于絮凝体系的稳定和沉淀[18]。

图5 絮凝剂投加量对絮凝效果的影响

2.6 金属离子对絮凝效果的影响

金属离子能促进高岭土悬浮液中颗粒的聚集沉降。由图6可知，KCl、NaCl和FeCl3助凝效果较差；FeSO4具有较好的助凝作用；CaCl2助凝效果最好，并且作为助凝剂添加到絮凝体系中不会带来二次污染。

图6 无机金属离子对絮凝效果的影响

一般认为，一价的金属阳离子因只能和悬浮颗粒或者微生物絮凝剂中的一个发生键合，所以不能连接悬浮颗粒与微生物絮凝剂；三价的金属阳离子由于其离子强度高，会过多占据微生物絮凝剂的活性位点，不利于微生物与悬浮颗粒结合，二价金属阳离子刚好在絮凝剂分子与悬浮颗粒间以离子键结合，可以促进絮凝[19]。所以二价的钙离子和铁离子絮凝率相对较高，其中钙离子是最佳的助凝剂。

2.7 钙离子浓度对絮凝效果的影响

由图7可知，添加不同浓度的钙离子对絮凝体系的助凝效果不同，在钙离子浓度较低的时候，随钙离子浓度增加，絮凝率逐渐增高。当钙离子浓度达到7 mmol/L 时，絮凝率最高达到 68.97%；超过 7 mmol/L后，絮凝率开始降低。多价金属离子可以与胶体颗粒相结合后中和负电荷，使胶体减少静电斥力，更易形成絮体，然后在微生物絮凝剂的作用下形成更大的絮团，但过量的金属离子会占据微生物絮凝剂的活性位点，反而抑制了絮凝效果[20]。

图7 Ca2+浓度对絮凝效果的影响

3 结论

用具有絮凝活性的志贺氏菌ZF-1培养产生的絮凝剂ZF-1C进行絮凝特性的研究，改变反应体系pH值、ZF-1C投加量、金属离子的种类、CaCl2浓度均会影响絮凝剂的絮凝效果，得出最佳pH值为7、ZF-1最佳投加量为4 ml/L、CaCl2最佳浓度为 7 mmol/L。在实际运用中，絮凝剂投加在污水中时需要考虑絮凝剂的反应体系环境，才能发挥絮凝剂的最佳絮凝效果。