新疆盐碱土壤耐盐碱放线菌筛选初步鉴定

宋阳，王秋菊，杨旭，杨财容，张硕，王芳，刘松青

（成都师范学院 化学与生命科学学院，四川成都 611130）

盐碱地是指表层含有盐碱成分且只生长有天然耐盐植物的土地。我国的盐碱地面积为9 913万公顷，约为全世界的10%，主要分布在淮河以北、西北及新疆、青藏高原等内陆干旱、半干旱地区[1]。盐碱地的形成虽然严重制约了农业发展，但同时也是很珍贵的土地资源，许多耐盐碱植物以及大量的微生物繁衍生息在这一特殊的生态环境中。盐碱危害造成大量中、低产田和农民贫困，使大面积土壤资源难以被利用，农业的综合生产能力下降，严重影响了农业生产发展和农民生活水平的提高。盐碱土壤的修复是生态环境修复的一个重要方面，但是如今各种改良方法都存在着不足，主要是因为盐碱土环境的特殊性，造成某些产酸菌很难在其中生长，并且由于盐碱土属于极端环境，目前的分离方法还不能分离出足够多的有效菌株，所以能够应用于盐碱土的微生物菌剂也较少。而研究出来的少数菌剂由于盐碱土本身存在的差异，只能在极小的范围内应用[2]。

放线菌是一类极其重要的微生物资源[3]。在放线菌的研究进程中，一个重要趋势就是研究极端环境（包括极端高、低温，极端高酸、高碱、高盐、高渗透压、高辐射等）中的放线菌[4]。放线菌可以合成维生素、纤维素酶、淀粉酶、氨基酸等多种有用的代谢产物，其中很多都已经产生巨大的经济效益[5]。目前，美国、日本以及欧洲的许多国家都相继启动了极端微生物的研究。1941年，Darling等[6]调查南极的微生物区系时，就分离出了能在-60～0℃生长的链霉菌及诺卡氏菌，而极端环境中放线菌的研究真正始于20世纪70年代。1982年，欧洲无细胞壁极端微生物实验室（European Laboratory Without Walls on Extremophiles）对极端环境中的微生物进行了广泛的研究[7]。1993年，德国召开了第一次极端环境微生物大会[8]。与此同时，一个关于极端环境微生物的研究计划（Aguilar 1996）又在欧盟各国开始实施，使国际上对极端环境微生物的研究工作得到了极大的加强[9]。1999年，云南大学省微生物所召开的第一届国际极端环境放线菌生物学讨论会，极大地推动了极端环境放线菌领域的研究[10]。最近20年来，极端环境微生物的研究受到了更广泛的重视。本实验采用同时提高盐碱度的方法来对放线菌进行筛选，以筛选出同时具备抗盐和抗碱双重特性的菌种，并将筛选到的高效率抗盐碱菌进行相关鉴定。期望通过研究新疆盐碱地区的放线菌，为极端环境微生物的研究和微生物菌剂的制备打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品

盐碱土壤样品共9份，均采自新疆盐碱地，采集土样均为0～12cm的表层土，无菌袋分装带回放于实验室4℃冰箱中保存，分别编号1～9，土壤样品的详细信息如表1所示。

1.1.2 培养基

改良高氏一号培养基、高氏一号琼脂培养基、淀粉水解琼脂、柴斯纳培养基、黑色素产生培养基、纤维素培养基、硝酸盐还原培养基、明胶液化培养基、碳源利用试验培养基、氮源利用基础培养基、牛奶凝固与胨化培养基[11-12]等按文献配制。

1.2 试验方法

1.2.1 分离方法

采用土壤悬液稀释涂布平板法分离菌种：从混匀了的各备用土样中随机取土样5 g，加入烘箱中进行120℃烘干处理1h[11]。从中称取2g，加入盛有18 mL无菌水的 100 mL 锥形瓶中，置 28 ℃、150 r/min 摇床上培养1 h。取摇匀的土样悬液0.2 mL涂布于分离平板上，28 ℃培养2周。

1.2.2 菌种纯化与保藏

在28 ℃条件下，自培养了2周的平板上挑取单菌落，接种于改良高氏一号培养基平板上，用划线法纯化菌株，并挑取纯化菌株的单菌落接种于改良高氏一号培养基相同的斜面上作为菌种的初步保藏。将纯化后的菌株用高氏一号液体培养基在28 ℃、150 r/min摇床中培养3～5 d，配制浓度50%的甘油，将甘油与菌液按体积比1∶1混合，保藏于-80℃冰箱中。

1.2.3 NaCl耐受实验

采用含有5%、10%、12%、14%、16%、18%及20% NaCl梯度的改良高氏一号培养基，28 ℃培养5～10 d后，观察各放线菌菌株的生长状况。

1.2.4 耐碱实验

保持改良高氏一号培养基NaCl浓度（5%）不变，分别调 pH 至 9、10、11、12，28 ℃培养 5～10d，观察各菌株的生长状况。

表1 不同盐碱代表区的土壤样品

1.2.5 耐盐碱实验

以改良高氏一号培养基为基础培养基，同时提高NaCl和pH值，即培养基盐浓度提高为5%、10%、15%、20%，pH分别对应为9、10、11、12，28 ℃培养5～10d，观察各菌株的生长状况。

1.3 耐盐碱放线菌的初步鉴定和划分

1.3.1 形态及培养特征观察

利用插片法[12-13]把灭菌盖玻片插于有放线菌的改良高氏一号平板，每个平板插3片，培养7～10d后，在电子显微镜下观察，记录好菌株的培养特征。

1.3.2 生理生化鉴定

淀粉水解试验、硫化氢产生试验、黑色素产生试验、纤维素分解试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、唯一碳源和氮源的利用试验、生态条件试验等参照文献[14]。

2 结果与分析

2.1 样品粗筛结果

从新疆9个盐碱区带回的土壤中，通过高氏一号培养基进行富集培养，并用改良高氏一号培养基进行菌株的筛选，纯化2～3次。每个土壤设置3个梯度，3个重复。最后从9个土壤样品中初步筛选出了19株耐盐碱菌，斜面保种备用，并以地区编号依次命名。

由表2可以看出，从巩留县伊利沙土、巩留县伊利沙地、轮台果树资源铺这3个地区筛选出的耐盐碱菌最少，均只有一株；而轮台沙地、轮台棉花地、呼图壁县边棉花地和博乐叉口4地均筛出了3株菌。

表2 不同地区初筛耐盐碱菌株结果

2.2 复筛纯化及盐碱耐受度分析

为探究19株菌对盐碱的耐受度，对初筛菌株进行盐与碱的耐受度试验。根据在同等实验条件下，菌株的生长状况、生长大小等标准对菌株耐盐、耐碱结果进行判断并记录，记录结果如表3所示。

由表3可以看出，耐盐实验中，菌株1-1、1-2、3-1、6-1、6-2、6-3、7-1、8-1、8-2、8-3、9-2在不同盐度耐受度实验中都能生长良好；菌株4-1、5-3、7-2、9-3对高盐环境的适应性差，随着盐度的提高，逐步表现为不能生长。耐碱实验中，菌株2-1、3-1、4-1、6-2、6-3、7-1、8-2、9-1、9-2 等在不同浓度的碱环境中均能正常生长，而菌株5-2、8-1随着碱浓度的提高，逐步表现为不能生长。

表3 不同菌株对盐或碱耐受度的实验结果

2.3 耐盐碱实验结果及分析

为筛选出同时具备耐盐及耐碱作用的菌株，对菌株进行耐盐碱实验。菌株4-1、5-2、7-2、9-3在单一耐盐实验中随着盐度的提高，表现为不能生长。对除去这4株菌以外的菌株进行盐碱耐受试验。在同等试验条件下，根据菌株的生长状况、生长大小等标准对菌株耐盐碱结果进行判断及记录，记录结果如表4所示。

表4与表3相比，菌株在盐碱的双重作用下，只有菌株1-1、5-1、5-2、6-1、8-1、8-3、9-2能够正常生长，表现为既耐碱又耐盐，可能是由于高盐碱环境使得菌株体内的耐盐碱机制发生了变化。其中菌株8-3对盐碱的耐受度表现最佳，在盐浓度为20%、pH值为12的培养基中也能生长。其中，菌株7-1在不同盐碱度的培养基中生长状况均表现为最差。

表4 各菌株在不同浓度的盐碱环境中的生长状况

2.4 菌种生理生化鉴定结果

根据耐盐碱实验的结果，挑选了6株菌进行生理生化鉴定。

2.4.1 形态观察及培养特征

利用高氏一号培养基培养菌株，进行初步的形态特征及培养特征的观察。观察结果如表5所示。各菌株在高氏一号培养基上的生长状况和培养特征具有很大的差异，因此为了进一步对各菌株进行鉴定。对各菌株进行了生理生化鉴定实验。

2.4.2 生理生化鉴定结果

对挑选出的各菌株进行生理生化鉴定，其试验的结果如表6所示。所有的菌株均能使明胶液化，除8-1以外各菌株均能利用不同的碳源，除菌株5-1以外所有的菌株均不能产黑色素，不同的菌株在生理生化鉴定中表现出不同的理化反应，可以判断以上菌株属于不同的属或种。

表5 各菌株形态特征及培养结果

表6 各菌株生理生化鉴定结果

由表7可以看出，菌株5-2能利用所有的氮源，而菌株8-1对各氮源的利用表现为最少。其余菌株均能对不同的氮源进行利用。

由表8可以看出，菌株1-1、5-1随着温度的升高，生长受到抑制；菌株5-2能够在不同的温度下正常生长，不受温度的限制；菌株6-1在25 ℃时表现为不能生长，随着温度的升高表现为正常生长；菌株8-3在25～45 ℃下能够正常生长，当温度高于45 ℃时，生长受到抑制。

根据阎逊初1992年出版的《放线菌的分类与鉴定》以及《链霉菌鉴定手册》[15]对上述6株菌进行初步分类和鉴定，结合菌株形态及生理生化反应结果进行分析。经过初步鉴定，6株菌的初步鉴定结果为1-1、5-1、8-1属于拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis），5-2、6-1属于链霉菌属（Streptomyces），8-3属于诺卡氏菌属（Nocardia）。

表7 各菌株的唯一氮源利用试验结果

表8 各菌株在不同温度下的生长状况

3 结论与展望

从新疆盐碱地区带回9份供试土壤，对其进行放线菌的筛选、分离和鉴定，以期从中筛选出能够耐高盐碱的放线菌。通过高氏一号培养基从9份土壤中分离纯化得到了19株放线菌，通过盐浓度耐受试验、碱浓度耐受试验以及盐碱耐受试验，最终从中挑选出了6株效果最好的菌。通过对6株放线菌的形态特征观察、培养特征观察以及生理生化鉴定，最终初步鉴定出这6株菌有拟诺卡氏菌属3株，链霉菌属2株，诺卡氏菌属1株。

由于实验室的条件限制以及盐碱土壤保存时间过长的原因，只从9份供试土壤中挑选出了6株耐盐碱放线菌。对于这6株菌的鉴定也只完成了生化反应的部分，目前只得到了各菌株的属，想要知道他们真正属于哪个种，则还需要对菌株进行分子方面的研究。因此，菌株鉴定方面还存在一定的缺陷。且由于供试土壤长期存放在冰箱中，一些菌株不能通过稀释平板法分离出来，可能土壤中还存在很多耐盐碱效果更好的菌株。从盐碱土壤微生物资源中分离筛选、开发出功能微生物，将会为改良盐碱土壤、药物研究、发酵工业等领域提供新的资源，为农业的可持续发展、生态环境的保护等方面提供重要依据。