通过抑制PDHK3的表达降低乳酸水平增加CHO细胞抗体表达量

李鹃，蔡洁行，张峥，朱焕章

（1.复旦大学，上海 200433；2.上海药明生物技术有限公司，上海 200131）

随着生物制药行业的蓬勃发展，CHO细胞蛋白生产的需求日益增加[1]。细胞群批次补料可以在较短时间内提供克级以上蛋白用于研发等用途，因此其应用越来越广泛[2]。批次补料过程中，各种代谢废物也在培养体系中不断堆积，造成细胞周围环境逐渐恶化[3-5]，细胞活率降低，从而影响蛋白最终产量。

本研究针对丙酮酸脱氢酶激酶3（PDHK3）设计3组特定的shRNA（PDHK3-1、PDHK3-2、PDHK3-3），并将其分别克隆至WuXi Biologics载体中。为加强shRNA的抑制效果，将设计的3组shRNA以1∶1∶1进行混合，在CHO细胞群构建时将含有这些混合质粒与待表达蛋白的质粒一同转染进入宿主细胞中。在批次补料实验中发现，通过转染8组不同的蛋白分子，批次补料过程中每一组的乳酸含量均得到明显降低，同时蛋白表达量得到显著提高。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂、试剂盒与仪器

shRNA质粒提取使用试剂盒（MACHEREYNAGEL）；PDHK3基因mRNA水平检测使用RTPCR试剂盒（Invitrogen）及PCR试剂盒（TaKaRa）；转染过程使用电转试剂（Lonza）。

Vicell细胞计数仪（Beckman，XR）、细胞培养生化分析仪（NoVa，FLEX）、高效液相色谱（HPLC）（Agilent，1260 Infinity Ⅱ）

1.1.2 质粒、菌株与宿主细胞

质粒、菌株、细胞系等宿主细胞CHOK1、WuXi Bio表达载体和感受态TOP10为WuXi Biologics平台所有，PDHK3-shRNA及shRNA阴性对照的目的基因合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成，含有PDHK3-shRNA或者shRNA阴性对照的目的基因由苏州金唯智生物科技有限公司克隆至WuXiBio表达载体，完成重组菌株的制备。

1.1.3 引物与探针

1.1.3.1 PDHK3基因的mRNA水平检测

正向引物：TGGCGAACACAATGAGAGAAGT；反向引物：TGCATGTACCAACTCTGAACTAATCC；探针：AATCTTTTGCCGGATAAC。

1.1.3.2 neomycin基因拷贝数检测

正向引物：TGCCGAATATCATGGTGGAA；反向引物：GCCAAGCTCTTCAGCAATATCA；探针：TGGCCGCTTTTCT。

1.2 方法

1.2.1 shRNA质粒的构建

选取PDHK3的3个目的区域：5’-GGACTTCGGAAGAGATAATGC-3’（ORF 327～347）；5’-GCTACTCTGTGAACAGTATTA-3’（ORF 843～863）；5’-GCCCTTTCAAGTGAATCATTT-3’（ORF1306～1326）。

含有PDHK3基因的shRNA质粒设计为含有反向互补的目的基因序列，中间由一茎环（TTGATATCC）序列分割，组成短发夹结构。

同时设计含有阴性对照shRNA的质粒：GTCGC TTACCGATTCAGAATGGTTGATATCCGCCATTCTGA ATCGGTAAGCGAC。

合成以上基因序列，分别添加 5’（BamHI）、3’UTR（[ACATTGATTATTG]）和 3’（SpeI），将基因通过 5’BamHI和 3’SpeI克隆至载体 WuXi Bio 表达载体（Ampicillin），制备重组质粒DNA及重组菌株。

1.2.2 宿主CHOK1细胞培养

宿主CHOK1细胞使用摇瓶在CD CHO培养基中传代培养，每隔3～4 d进行传代，摇床培养条件为温度36.5 ℃，二氧化碳浓度6.0%。

1.2.3 转染CHO细胞并进行加压筛选构建细胞系

使用电转试剂（Lonza）进行转染，转染条件设置见表1。

表1 转染条件设置

单独转染含有表达目的蛋白质粒，共转含有针对PDHK3-shRNA（1+2+3）的混合质粒和含有表达目的蛋白质粒，单独转染含有阴性对照shRNA的质粒3种条件，8个蛋白分子共转染24个细胞系。其中PDHK3-shRNA混合质粒中3个shRNA的比例为1∶1∶1。

转染24 h后，通过加入含有相应抗生素的筛选培养基进行CHO细胞筛选，每隔2～4 d以0.7×105～3.0×105cells/mL 的密度进行传代。经过2～3周传代，细胞活率恢复到95%以上，筛选出能够表达目的蛋白及shRNA-PDHK3的细胞系。

1.2.4 批次补料实验及乳酸含量、抗体蛋白表达量检测

筛选结束后，以3～7 E5密度接种摇管批次补料实验，接种后根据细胞生长进行多次补料。Vicell细胞计数仪检测细胞活率、细胞密度，NoVa仪直接检测上清液中乳酸含量。第14 d收获上清样品，使用HPLC检测各个抗体蛋白分子目的蛋白的表达量。

1.2.5 PDHK3基因mRNA水平检测

收集批次补料细胞沉淀，提取总RNA并逆转录为cDNA。针对载体PDHK3基因区域设计引物和探针，利用qPCR方法检测PDHK3的mRNA水平。宿主CHO细胞的B2M为内参基因，PDHK3与B2M检测值的比值即可反映转入shRNA-PDHK3的细胞PDHK3基因的mRNA水平的变化趋势。

1.2.6 Neomycin基因拷贝数检测

收集批次补料第0 d细胞沉淀以及批次补料过程第10 d的细胞沉淀，分别提取每个样品的基因组DNA。针对载体Neomycin基因区域设计特定的引物和探针，利用ddPCR技术定量检测Neomycin基因拷贝数，通过该基因的拷贝数间接反应PDHK3-shRNA的基因拷贝数情况。

2 结果与讨论

2.1 批次补料抗体蛋白表达量

在14 d左右的摇管批次补料实验中，于批次补料结束后收集上清液进行HPLC_ProteinA检测蛋白表达量。实验结果显示共转了PDHK3-shRNA的条件，第14 d的蛋白表达量提高了18.6%～233%，见图1。表明抑制PDHK2基因，可以有效提高抗体蛋白表达量。

2.2 批次补料过程乳酸表达量

批次补料过程中，收集上清检测乳酸含量的变化。实验组的乳酸表达量在第5～14 d表现出较大差别，乳酸含量在批次补料过程中不断降低，而对照组乳酸含量不断增加（除第5个分子），见图2。

2.3 PDHK3基因的mRNA表达水平

选取两个比较有代表性的蛋白分子进行PDHK3基因的mRNA表达水平检测。其中分子5是批次补料过程中唯一一个乳酸含量变化较小的分子，实验组乳酸堆积虽然相对对照组后期的乳酸较低，但并未随着时间的推移而逐渐降低。该分子的实验组相对于对照组的PDHK3基因的mRNA表达水平降低了76%。分子7蛋白表达水平提高了233%，是蛋白表达提高百分比最高的分子。该分子的实验组相对于对照组的PDHK3基因的mRNA表达水平降低了65%。通过实验可知，抑制PDHK3基因的mRNA表达可以降低乳酸表达，同时可以提高目的蛋白产量。

2.4 Neomycin基因拷贝数检测

4个分子（mAb1～mAb4）的实验组和对照组2转染的质粒中均含有Neomycin基因，拷贝数为4～9，见图4。由拷贝数检测实验可知，PDHK3-shRNA在转染过程及批次补料过程均有基因表达。

图1 抗体相对表达量

图2 乳酸表达量曲线

图3 PDHK3基因的mRNA相对表达水平

图4 Neomycin基因拷贝数

3 结论

将3个PDHK3-shRNA分别构建到WuXiBio载体中，这些混合质粒与表达不同蛋白的质粒分别共同转染至宿主CHO细胞中。通过对Neomycin基因拷贝数检测结果表明，构建的PDHK3-shRNA稳定转染并整合到CHO细胞的基因组DNA中。而PDHK3基因的mRNA水平显著降低且批次补料过程中乳酸含量降低，说明抑制PDHK3基因的表达可以降低乳酸含量。同时8个mAb实验组的蛋白产量均得到提高，推测是由于细胞生长环境如pH得到改善，更有利于细胞表达目的蛋白。

综上所述，本研究证明通过利用shRNA方法抑制PDHK3基因的表达，不仅可以降低乳酸表达量，同时能够提高目的蛋白的表达量。