数字化音乐电胃肠起搏对食管癌术后肠道屏障功能、炎症和氧化应激的影响

肖玉兰，齐科雷，王秀娟，李凤茹，吕翠环

作者单位：河北省胸科医院胸二科，河北 石家庄050041

食管癌是一种常见的上消化道恶性肿瘤，全世界每年约有40万新诊断的病人，发病率在所有恶性肿瘤中位列第八[1]，五年生存率仅为20%，是死亡率排名第六的恶性肿瘤[2]。手术是食管癌的主要治疗方式，术中常将胃颈部上提至胸腔与切除后的残余食管相吻合，使食管和胃的正常解剖位置发生变化，胸腔中的负压环境会导致胃与十二指肠的压力梯度降低，不利于胃的蠕动和排空[3-4]。此外，促胃肠蠕动激素分泌减少、迷走神经干的切断导致胃张力降低，麻醉、卧床、紧张和焦虑等因素也会降低胃的张力，加重胃肠功能障碍[5]。关于食管癌术后导致胃肠功能紊乱的临床治疗仍然以禁食禁水、胃肠减压等一般措施为主，缺乏针对性的治疗方法，因此积极探索有效的治疗措施具有重要的临床意义。

数字化音乐电胃肠起搏是一种结合胃肠电刺激、足三里穴按摩、心理安慰等方法的综合性治疗方法，在一系列疾病中已经证实具有较好的治疗效果，包括难治性胃食管反流病、顽固性消化不良、便秘型肠易激综合征等[6-7]。胃肠动力障碍常会导致肠道黏膜水肿，正常的黏膜屏障功能减弱，细菌发生易位进入循环系统，使机体处于高炎症和高氧化应激状态，是食管癌术后胃肠功能紊乱病人重要的病理表现[8-9]。因此，本研究选取了拟行手术治疗的食管癌病人作为研究对象，术后使用数字化音乐电胃肠起搏进行治疗，以观察其对食管癌术后肠道屏障功能、炎症和氧化应激的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年3月至2018年6月期间于河北省胸科医院住院的120例食管癌病人作为研究对象，收集所有病人的年龄、性别、手术时间、手术失血量等一般资料。纳入标准：（1）经胃镜和病理活检确诊为食管癌病人，且未发生转移；（2）无手术禁忌症，拟行食管癌根治术者；（3）术前3个月未服用影响胃肠动力的药物。排除标准：（1）合并消化道出血、消化性溃疡等其他胃肠道疾病；（2）合并肝肾功能障碍、心脑血管疾病、皮肤疾病、精神疾病、感染免疫性疾病等。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 病人分组 将120例食管癌病人按照随机数字表法分为四组，即A、B、C和D组，每组共30例病人。研究结束时，A组共有29例病人，共剔除病人1例，为并发呼吸衰竭；B组共有27例病人，共剔除病人3例，2例为自行退出研究，1例为自行拔出胃管；C组共有28例病人，共剔除病人2例，1例为自行退出研究，1例为并发下肢静脉血栓；D组共有28例病人，共剔除病人2例，1例为因乳糜胸而需二次开胸手术，1例为并发呼吸衰竭。共计112例。

1.3 治疗方法 A组病人给予胃肠减压、禁食禁水、床上活动、翻身拍背等一般治疗措施。

B组病人在A组的基础上给予足三里穴按摩，具体方法为：用拇指指腹按压足三里穴，即腿膝盖骨外侧下方凹陷往下约4指宽处，力量由轻至重，循序渐进，病人有酸胀感为度，每日1次，每次30 min，共治疗7 d。

C组病人在A组的基础上给予胃肠起搏，具体方法为：（1）使用WCH型胃肠起搏器（杭州泰士生物科技有限公司）进行治疗；（2）在电极定位点处皮肤，使用95%的酒精棉球反复擦拭，直至皮肤泛红，以去除皮肤表面的角质和污垢，保证电极的导电性；（3）肠起搏器的正极置于脐上1～2 cm处，负极置于剑突和脐连线中点的右侧5 cm处；（4）肠起搏器的频率为12次/分钟，治疗幅度调整为150～250 μV，病人感觉贴电极处皮肤有轻微的针刺感或灼热感为宜；（5）每日1次，每次30 min，共治疗7 d。

D组在A组的基础上给予数字化音乐电胃肠起搏治疗，主要方法为：（1）使用CGP-Ⅰ型数字化音乐电胃肠多功能起搏器（重庆腾跃医疗器械有限公司）进行治疗；（2）皮肤准备和肠起搏器的电极定位点与C组一致，双侧穴位电极置于足三里穴处；（3）病人佩戴耳机，根据病人的喜好选择合适的音乐，控制音量在50～60 db，肠起搏器的频率为12次/分钟，根据病人的耐受程度调整治疗强度，约为0～21V，病人感觉贴电极处皮肤有轻微的针刺感或灼热感为宜；（4）每日1次，每次30 min，共治疗7 d。

1.4 检测指标

1.4.1 胃肠功能恢复 病人手术后开始观察并且记录肠鸣音恢复时间、排气时间、排便时间、胃管留置时间、胃液引流量。在病人的左上腹、左下腹、右上腹、右下腹分别听诊1 min，若两个部位听诊发现肠鸣音次数≥3次，即为肠鸣音恢复。在术后肠功能恢复的次日拔除胃管，即肛门排气的次日。

1.4.2 肠道屏障功能 于治疗结束后，抽取所有病人的肘正中静脉血5 mL，室温静置20 min，12 000 g离心15 min，吸取上层血清。使用酶联免疫吸附试验试剂盒检测所有病人血清中内毒素（晶美，JM-04464H1）、二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO，晶美，JM-03719H1）、紧密连接蛋白（Occludin，酶联，ml038179）、闭锁小带蛋白（Zonula occludens-1，ZO-1，晶美，JM-04961H1）的含量。

1.4.3 血清炎性因子 使用酶联免疫吸附试验试剂盒检测所有病人血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-10（IL-10）的含量。

1.4.4 外周血单个核细胞中炎症信号通路的表达

使用蛋白质免疫印迹检测外周血单个核细胞中Toll样受体-4（Toll-like Receptor 4，TLR4）/核因子-κB（Nuclear Transcription Factor-κB，NF-κB）信号通路的表达情况，具体步骤为：于治疗结束后，抽取所有病人的肘正中静脉血5 mL至肝素抗凝管，加入10 mL外周血单个核细胞分离液离心、分离；收集细胞后获得外周血单个核细胞。

向细胞中加入RIPA裂解液（碧云天，P0013），充分裂解后，12 000 g离心10 min，对上清液进行蛋白定量（碧云天，P0012）。取30 μg的总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将目的蛋白转印至PVDF膜。5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，使用抗TLR4抗体（1∶500，Abcam，ab13556）、抗 NF-κB 抗体（1∶500，Abcam，ab32360）、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（1∶2 000，Abcam，ab8245）4℃过夜孵育。洗涤3次后，加入二抗（博士德，BA1056）室温孵育2 h，洗涤3次，滴加ECL显色液（碧云天，P0018），凝胶成像仪（Bio-Rad，ChemiDoc XRS）曝光和拍照。使用Image Pro Plus 6.0软件测量各个条带的灰度值，将对照组中目的蛋白与GAPDH的灰度值之比作为1[10]。

1.4.5 氧化应激水平 使用黄嘌呤氧化酶法检测血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性，使用硫代巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）的含量。

1.5 统计学方法 使用SPSS 20.0软件进行统计学分析。所有计量资料均表示为，多组间计量数据的比较使用单因素方差分析，组内两两比较使用SNK-q检验。所有计数资料均表示为例，计数数据间的比较使用χ2检验。当P＜0.05时表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组病人一般资料的比较 四组病人在性别、年龄、手术时间和手术失血量方面均差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

2.2 四组病人胃肠功能恢复的比较 B组、C组、D组的肠鸣音恢复时间、排气时间、排便时间、胃管留置时间、胃液引流量均低于A组，且D组低于B组和C组，C组的肠鸣音恢复时间和胃液引流量低于B组（P＜0.05），见表2。

表2 食管癌112例术后不同治疗后胃肠功能恢复情况比较/

表2 食管癌112例术后不同治疗后胃肠功能恢复情况比较/

注：与A组相比较，aP＜0.05；与B组相比较，bP＜0.05；与C组相比较，cP＜0.05

images/BZ_84_236_402_2240_461.pngA组B组C组D组F值P值1334.50±211.80 1180.46±196.15a 1047.28±160.33ab 895.44±101.35abc 33.360 0.000 29 27 28 28 48.72±5.93 45.62±5.50a 41.04±6.11ab 36.20±5.15abc 26.120 0.000 68.17±6.45 63.48±6.70a 61.25±5.81a 52.87±4.51abc 33.060 0.000 87.20±6.67 79.95±7.69a 77.29±7.13a 73.42±6.92abc 19.140 0.000 97.34±8.19 91.17±6.89a 88.72±9.03a 80.95±7.65abc 20.470 0.000

表1 食管癌112例一般资料比较

2.3 四组病人肠道屏障功能的比较 B组、C组、D组血清中的内毒素、DAO、Occludin、ZO-1均低于A组，且D组低于B组和C组，C组血清中的Occludin低于B组（P＜0.05），见表3。

表3 食管癌112例术后不同治疗后肠道屏障功能比较/

表3 食管癌112例术后不同治疗后肠道屏障功能比较/

注：DAO为二胺氧化酶，Occludin为紧密连接蛋白，ZO-1为闭锁小带蛋白。与A组相比较，aP＜0.05；与B组相比较，bP＜0.05；与C组相比较，cP＜0.05

ZO-1（μg/L）31.01±4.33 27.36±4.02a 28.11±4.52a 23.55±3.60abc 15.690 0.000组别A组B组C组D组F值P值例数29 27 28 28内毒素（ng/L）11.83±3.62 8.55±2.19a 7.80±3.25a 5.37±2.40abc 23.510 0.000 DAO（U/L）3.69±0.53 3.31±0.64a 3.12±0.59a 2.71±0.70abc 12.410 0.000 Occludin（μg/L）21.56±3.94 19.49±2.88a 15.51±3.49ab 13.61±3.20abc 32.090 0.000

2.4 四组病人血清炎性因子的比较 B组、C组、D组血清中的TNF-α、IL-6、IL-8含量均低于A组，且D组低于B组和C组，C组血清中的TNF-α和IL-8含量低于B组（P＜0.05），但是四组间IL-10的含量比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 食管癌112例术后不同治疗后血清炎性因子比较/（ng/L，）

表4 食管癌112例术后不同治疗后血清炎性因子比较/（ng/L，）

注：与A组相比较，aP＜0.05；与B组相比较，bP＜0.05；与C组相比较，cP＜0.05

images/BZ_84_238_2789_1192_2849.png9.28±1.57 9.16±1.35 8.89±1.40 8.62±1.19 1.272 0.288 A组B组C组D组F值P值29 27 28 28 26.31±4.29 20.70±3.88a 17.65±3.24ab 12.35±3.61abc 67.860 0.000 33.72±5.44 25.09±4.85a 26.67±5.03a 16.48±4.01abc 60.250 0.000 82.67±12.55 72.63±11.44a 65.51±13.10ab 37.87±9.71abc 75.010 0.000

2.5 四组病人外周血单个核细胞中TLR4/NF⁃κB信号通路表达的比较 B组、C组、D组外周血单个核细胞中的TLR4和NF-κB蛋白表达量均低于A组，且D组低于B组和C组（P＜0.05），见图1和表5。

图1 蛋白质免疫印迹检测食管癌112例术后不同治疗后外周血单个核细胞中TLR4/NF-κB信号通路的表达

表5 食管癌112例术后不同治疗后外周血单个核细胞中TLR4/NF-κB信号通路表达的比较/

表5 食管癌112例术后不同治疗后外周血单个核细胞中TLR4/NF-κB信号通路表达的比较/

注：TLR4为T011样受体-4，NF-κB为核因子-κB。与A组相比较，aP＜0.05；与B组相比较，bP＜0.05；与C组相比较，cP＜0.05

images/BZ_84_1286_1864_2240_1923.png1.00±0.21 0.84±0.22a 0.45±0.16ab 0.28±0.13abc 93.700 0.000 A组B组C组D组F值P值29 27 28 28 1.00±0.24 0.86±0.15a 0.75±0.20ab 0.44±0.11abc 48.030 0.000

2.6 四组病人氧化应激水平的比较 B组、C组、D组血清中的SOD含量均高于A组，且D组高于B组和C组（P＜0.05）；血清中的MDA含量均低于A组，且D组低于B组和C组（P＜0.05），见表6。

表6 食管癌112例术后不同治疗后氧化应激水平的比较/

表6 食管癌112例术后不同治疗后氧化应激水平的比较/

注：SOD为超氧化物岐化酶，MDA为丙二醛；与A组相比较，aP＜0.05；与B组相比较，bP＜0.05；与C组相比较，cP＜0.05

images/BZ_84_1286_2788_2240_2848.png6.42±0.85 5.89±0.74a 5.65±0.80a 5.11±0.66abc 14.310 0.000 A组B组C组D组F值P值29 27 28 28 363.62±24.01 385.09±30.58a 391.33±27.44a 418.50±36.22abc 16.310 0.000

3 讨论

胃肠起搏是体外通过不同频率的电信号干预胃肠道的起搏点，使其恢复正常的电活动，以维持肠道的蠕动，在糖尿病胃轻瘫、麻痹性肠梗阻、功能性便秘、胃食管反流等疾病中具有良好的治疗效应[11]。胃的起搏点在胃大弯向头端约三分之一的部位，小肠的起搏点位于胃幽门下端4 cm的十二指肠球部，存在于平滑肌中的Cajal间质细胞被认为是起搏细胞，它与神经细胞和平滑肌细胞形成广泛的联系，以维持信号的传递，在疾病、手术等损伤环境下Cajal间质细胞的电活动发生紊乱，通过体外给予合适频率的电刺激，可以促进起搏点功能的恢复，这就是胃肠起搏的主要机制[12]。但是，除了起搏点电活动的紊乱，胃肠功能障碍还与心理、激素分泌、神经调节等因素有关，因此单纯实施体外胃肠起搏的临床效果可能并不理想。

研究发现，穴位按摩可以一定程度上促进胃肠蠕动，中医认为与气血调和、经络疏通有关，而西医则认为与刺激胃泌素分泌等机制有关[13-14]。此外，紧张和焦虑等心理因素也被认为是胃肠功能恢复的不利因素，适当地开展音乐疗法可以有效地增强肠道蠕动，促进术后病人恢复。因此，有学者将穴位按摩、音乐疗法与传统的胃肠起搏相融合，发展为数字化音乐电胃肠起搏，并在难治性胃食管反流病、顽固性消化不良、便秘型肠易激综合征等疾病中证实具有较好的治疗效果[6-7]，但是这些研究仅探讨了数字化音乐电胃肠起搏相对于一般治疗的优势，未与单纯的穴位按摩和传统的胃电起搏相比较，无法证实数字化音乐电胃肠起搏作为一种综合性治疗方式的优势。

本研究结果发现在一般治疗措施的基础上开展穴位按摩或者胃肠起搏均可以改善食管癌术后病人的肠道屏障功能，促进胃肠功能恢复，而且数字化音乐电胃肠起搏优于单纯的穴位按摩或者单纯的胃肠起搏，表明实施胃肠起搏、穴位按摩和音乐疗法的综合性治疗具有复合效应。当肠道屏障功能受到损害时，细菌内毒素通过上皮屏障大量进入血液循环系统，在树突状细胞等抗原提呈细胞的识别与介导下，活化淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞，使其不断分泌TNF-α等炎性因子，加重氧化应激反应，因此高炎症和高氧化应激状态常是胃肠运动障碍的伴随表现[15-16]。进入循环系统的内毒素可激活TLR4/NF-κB信号通路，也是肠道屏障功能障碍时炎性因子大量分泌的主要机制，Luo等[17]发现TLR4/NF-κB信号通路的活化参与肠道上皮结构的破坏与下游TNF-α、IL-6等炎性因子的释放，使用NF-κB抑制剂可以显著降低炎症水平以及肠道细菌移位情况。综上，本研究对病人血清中的炎性因子和氧化应激指标进行了检测，结果显示与单纯的胃肠起搏和穴位按摩相比较，数字化音乐电胃肠起搏组病人血清中TNF-α、IL-6、IL-8和MDA的含量较低，SOD的含量较高，外周血单个核细胞中TLR4和NF-κB的表达量较低，表明数字化音乐电胃肠起搏可以有效地降低食管癌病人术后的炎症和氧化应激水平。

本研究的不足之处：（1）纳入的病例数较少，相关数据的稳定性较差，未来仍需要积累病例资料；（2）虽然分离了病人的外周血单个核细胞，对TLR4/NF-κB信号通路的表达情况进行了检测，但是临床上无法获得除血清以外的组织样本，机制研究难以开展，数字化音乐电胃肠起搏对食管癌术后病人的保护机制仍不清楚；（3）除食管癌根治术外，肠道功能紊乱还发生于腹部手术、放化疗、脊髓损伤等治疗或疾病[18-19]，数字化音乐电胃肠起搏是否在这些疾病中也具有保护作用仍待研究。