高效液相色谱⁃电雾式检测法测定甘草中4种有效成分的含量

2020-07-06任霞胡冲张亚中

安徽医药 2020年7期

任霞，胡冲，张亚中

作者单位：1安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230031；2安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051

甘草（Radix Glycyrrhizae）为豆科植物Glycyrrhiza uralensis Fisch.胀果甘草或光果甘草的干燥根及根茎，是我国医药管理部门收载和管理的重要中药材之一[1]。甘草也是临床上应用最广泛的传统中药，始载于东汉时期我国古代第一部药学专著《神农本草经》，被列为上品，味甘、性平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、止咳祛痰、缓急止痛、调和诸药的功效[2-3]。甘草中主要有效成分分为两种，一为三萜类化合物，包括甘草酸、甘草次酸等。二为黄酮类化合物，包括芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草素等。最初认为甘草的药理作用均起因于甘草中三萜类成分，其主要药理作用包括抗炎、抗过敏、保肝、抗癌等[4-9]。自被报道甘草抗溃疡作用来源于甘草黄酮后，甘草中黄酮类成分才得到高度的关注，目前已经证实黄酮类成分存在抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、激素样作用、降糖、降脂、解痉、抗抑郁等药理作用[9-14]。

自2010版《中国药典》后，甘草质量标准由控制三萜类化合物甘草酸单一成分，增加为三萜类化合物甘草酸和黄酮类化合物甘草苷两种成分。但经HPLC检测可知，色谱图中有的峰型一般、基线不平稳，故尝试高效液相色谱-电雾式检测器（HPLCCAD）方法进行检测[15]。HPLC-CAD具有较宽的动态检测范围、较高的灵敏度和重复性等优点，应用于中性、酸性、碱性及两性物质等，特别是无紫外吸收、非挥发性或半挥发性物质的检测[16-17]。

本研究自2017年6月至2019年6月，完成不同产地乌拉尔甘草的收集和用HPLC-CAD检测方法对甘草药材中4种成分的含量检测，为甘草今后的质量标准制定提供有意义的参考。

1 仪器与试药

Ultimate 3000液相色谱仪（美国Dionex公司）配备Corona Ultra电雾式检测器及Chromeleon 7.2色谱工作站，紫外检测器（美国Dionex公司DAD），分析天平（Mettler Toledo XP26、Mettler Toledo AG285），超声仪（Elmasonic S），Millipore Simplicity-185型超纯水仪（美国Millipore公司）。Waters XBridge C 18色谱柱（填料：十八烷基硅烷键合硅胶；4.6 mm×250 mm，5 μm）。

芹糖甘草苷对照品（上海诗丹德生物技术有限公司，生产批号6797，含量98%；）、甘草苷对照品（中国生物制品检定研究院，生产批号111610-700604，含量100%；）、芹糖异甘草苷对照品（上海诗丹德生物技术有限公司，生产批号5063，含量98%；）及甘草酸对照品（中国食品药品检验研究院，生产批号110731-201720，含量97.9%；）乙腈：质谱纯；甲酸（99.5%）：色谱纯；水：超纯水；甘草样品收集信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，A相维持在19%；8～35 min，A相由19%上升至50%；35～36 min，A相上升至100%；36～37 min，A相由100%下降至19%；37～47 min，A相维持在19%；），流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；电雾式检测器：雾化温度为40℃、气源为N2、压力4.156×105Pa。

表1 甘草样品来源

2.2 对照品溶液的配制取对照品芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸适量，精密称定，加适量70%乙醇超声溶解，冷却后再用70%乙醇定容到刻度，最终得到各对照品浓度1分别为0.039 21、0.034 29、0.032 19和0.169 37 mg/mL。

取对照品芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸适量，精密称定，加适量70%乙醇超声溶解，冷却后再用70%乙醇定容到刻度，最终得到各对照品浓度 2分别为 0.818 0、0.710 8、1.580 3和6.375 0 mg/mL。

2.3 线性关系的考察精密量取“2.2”项下芹糖甘草苷对照品溶液1、甘草苷对照品溶液1、芹糖异甘草苷对照品溶液1和甘草酸对照品溶液1不同体积溶液，注入高效液相色谱仪，采用CAD进行分析。以质量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，最终得到4种成分线性回归方程见表2。

表2 线性回归方程

结果表明，4种成分的线性关系良好，相关系数均大于0.999 0。

2.4 供试品溶液的制备取甘草药材粉末（过三号筛）约0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇

100 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 精密度试验精密量取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次依法测定，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸各峰面积相对标准偏差（RSD）结果分别为1.95%、1.99%、2.05%和1.13%（n＝6），RSD＜3.0%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一供试品溶液，于配制后0、3、6、12、24、36、48 h分别精密量取10 μL，注入液相色谱仪，采用CAD检测器进行分析，测定芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸各峰面积RSD分别为1.12%、2.23%、1.89%和2.01%（n＝7），RSD＜3.0%，表明样品在48 h内稳定。

2.7 重复性试验取甘草药材粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，照“2.4”项下方法，共制备6份供试品溶液，分别取10 μL注入液相色谱仪，测定含量。结果甘草药材中平均含量为2.05%、4.73%、0.80%和9.72%，4种成分含量结果的RSD分别为1.19%、1.78%、1.28%和1.89%（n＝6），RSD＜3.0%，表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验取甘草药材约0.1 g各6份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加芹糖甘草苷对照品溶液2（0.818 0 mg/mL）、甘草苷对照品溶液2（0.710 8 mg/mL）、芹糖异甘草苷对照品溶液2（1.580 3 mg/mL）和甘草酸对照品溶液2（6.375 0 mg/mL）各2.5、6.5、0.5、1.5 mL，平衡操作6次，加入相应量70%乙醇，使总溶液量为100 mL，密塞，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。各取10 μL，注入液相色谱仪，测定含量，计算加样回收率，结果见表3～6。

表3 芹糖甘草苷的回收率试验结果

表4 甘草苷的回收率试验结果

表5 芹糖异甘草苷的回收率试验结果

表6 甘草酸的回收率试验结果

2.9 供试品含量测定取甘草药材，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸的含量，结果见表7及图1。

3 讨论

3.1 检测器的选择 HPLC-CAD色谱图基线较为平稳、峰型良好、分离度良好、灵敏度高，故选择HPLC-CAD进行各成分的含量测定。CAD是一种新型通用性检测器，不依赖于化合物的分子结构，对大多数化合物响应性一致，有着灵敏度高、低检测限、重现性好、稳定性好等优点。

3.2 色谱条件的优化 CAD检测器适用挥发性的有机酸，所以本试验对有机酸进行了筛选，尝试用乙腈-甲酸和乙腈-乙酸和乙腈-三氟乙酸流动相系统，其中以乙腈-甲酸流动相分离效果最佳，且基线较为平稳，经进一步优化后，确定了本试验的乙腈-0.05%甲酸溶液作为流动相体系，各色谱峰分离效果良好，噪音小，系统较为稳定可行。

3.3 甘草含量测定结果的分析用HPLC-CAD方法测定甘草药材的含量结果是：芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸的含量分别在0.26%～2.27%、0.33%～5.07%、0.14%～0.81%、0.77%～9.76%范围。根据2015版本《中国药典》甘草含量测定项下限度要求：甘草苷不小于0.5%，甘草酸不小于2.0%，只有GC-007和GC-008批次甘草样品含量不符合规定，其余均符合药典要求。

此收集的甘草均为乌拉尔甘草，产地分别为新疆库尔勒、新疆轮台、内蒙古呼和浩特、内蒙古赤峰和甘肃兰州。从不同成分进行分析，芹糖甘草苷成分：新疆两个产地＞内蒙古两产地＞甘肃兰州；且新疆两产地含量相近、内蒙古两产地的含量也相近。甘草苷成分：新疆两产地＜甘肃兰州＜内蒙古两产地；新疆两产地含量相近，内蒙古两产地含量相差较明显，内蒙古赤峰产地中的甘草苷是其他产地的约3～5倍；芹糖异甘草苷成分：新疆两产地＞内蒙古两产地大于甘肃兰州；且新疆两产地含量相近，内蒙古两产地也含量相近。甘草酸成分：明显可以看出新疆和内蒙古两产地的含量较高于甘肃兰州。根据以上结论，可为选用不同产地甘草提供依据，如主要作用于抗炎、抗过敏、保肝、抗癌等[4-9]的，则可以选择内蒙古和新疆产地的甘草药材，尤其可以选择内蒙古赤峰产地。如主要作用于抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、激素样作用、降糖、降脂、解痉、抗抑郁等药理作用[9-14]的，则可选择新疆和内蒙古两产地，尤其可以选择内蒙古赤峰的。

本研究采用HPLC-CAD技术，对甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸4种成分进行含量测定，快速、准确，可为客观评价甘草质量提供科学依据。