植物氮源对透明质酸发酵的影响

李黔蜀

(杨凌职业技术学院 药物与化工分院，陕西 杨凌 712100)

透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)，是一种大分子量的多糖物质，具有独特的分子结构，具备优良的保湿性能、生物相容性和粘弹性，因而在化妆品、生物医药、食品等领域得到了广泛的应用[1]。透明质酸的生产方法主要有提取法、微生物发酵法和化学合成法，其中，微生物发酵法因其成本低、产量高且易于分离纯化等优点而成为当前透明质酸生产最主要的方法[1～2]。在透明质酸发酵的研究中，发酵培养基一般都使用牛肉膏和蛋白胨作为氮源，很少有使用植物氮源的报道[3～5]。牛肉膏等动物蛋白的价格要比植物蛋白高得多，如果采用植物蛋白作为氮源，则能大大降低透明质酸发酵的成本。试验以工业上常用的小麦胚芽蛋白、大豆蛋白和棉籽蛋白等七种植物蛋白代替牛肉膏和蛋白胨作为氮源进行透明质酸发酵，研究了直接添加、酸解、碱解以及酶解这几种植物氮源的不同处理方式对透明质酸发酵的影响，以筛选出适合兽疫链球菌进行透明质酸发酵的植物氮源。

1 菌种与培养基

实验菌种为兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus(杨凌职业技术学院 药物与化工分院实验室保存)。

种子培养基 葡萄糖5 g·L-1，牛肉膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，磷酸氢二钾2 g·L-1，七水硫酸镁1 g·L-1；pH 7.0～7.2。

发酵培养基 葡萄糖50 g·L-1，植物蛋白30 g·L-1[6]，酵母粉5 g·L-1，磷酸氢二钾2 g·L-1，七水硫酸镁1 g·L-1。其中，植物蛋白种类和规格见表1。

表1 植物蛋白技术指标

2 实验方法

2.1 摇瓶种子培养

取保存于斜面的菌种两环，接入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，转速150 r·min-1，37 ℃，培养12 h左右。

2.2 摇瓶发酵培养

250 mL三角瓶中加入50 mL培养基，接种量10%(体积分数)，转速150 r·min-1，37 ℃，培养24 h左右。

2.3 小罐发酵培养

美国贝朗30 L全自动发酵罐，加入13 L发酵培养基，发酵条件见参考文献[6]。

2.4 分析方法

菌体浓度测定。采用600 nm下发酵液的吸光度(A600)来表征菌体浓度，将发酵液稀释10倍后用分光光度计进行测定。

葡萄糖和乳酸质量浓度测定。采用SBA_40C型生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行测定。

透明质酸质量浓度测定,采用咔唑法[6]

3 结果与讨论

3.1 摇瓶中不同植物氮源对透明质酸发酵的影响

3.1.1 植物蛋白直接添加作为氮源进行发酵 将植物氮源按30 g·L-1添加到培养基中，对照组中采用牛肉膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1作为氮源(下同)，发酵结果见图1。

注：1发酵用小麦胚芽蛋白粉；2发酵用豆粕；3发酵用豆饼粉(热榨中温)；4发酵用花生饼粉；5发酵用大豆蛋白粉；6发酵用豆饼粉(冷榨)；7发酵用棉籽蛋白；8牛肉膏蛋白胨(对照)

图1不同植物蛋白直接添加作为氮源对HA发酵的影响

由图1可以看出，植物蛋白直接作为氮源进行发酵能生产出透明质酸，得到的HA产量都高于对照组，其中，小麦胚芽蛋白和棉籽蛋白的效果最好，HA产量达到了0.7 g·L-1以上，其他几种植物蛋白的发酵结果则比较接近，相比对照组提高不多，HA产量在0.5 g·L-1左右。使用粉末状植物蛋白直接作为氮源时，发酵液中会有许多固体物质，发酵结束时仍有很多不溶物，这些固体物质都是微生物不能直接利用的，因而HA发酵效果有限。将植物蛋白分别用酸、碱或酶进行水解，可以将大分子物质和固体不溶物转化成小分子物质，从而提高植物氮源的利用率。小麦胚芽蛋白和棉籽蛋白直接添加时，效果较好，因此选这两种氮源进行水解试验。

3.1.2 植物蛋白水解液作为氮源进行发酵 主要有:

(1)酸或碱水解植物蛋白作为氮源。酸解：pH 2.0，100 ℃水解10 h；碱解：pH 10.0，100 ℃水解10 h。水解完成后，按比例向水解液添加其他培养基组分，然后进行摇瓶发酵培养，结果见图2。

图2 酸和碱水解蛋白作为氮源对HA发酵的影响

如图2所示，棉籽蛋白碱水解液HA产量在0.6 g·L-1左右，相比于直接添加，效果反而变差了；酸水解液则几乎没什么效果，无法用作氮源。小麦胚芽蛋白酸或碱水解液的HA产量在0.8～0.9 g·L-1左右，与直接添加的结果差不多。总的来说，两种氮源都是用碱水解的效果要好一些，但是酸或碱水解并没有使HA产量得到明显提升，并且在发酵液处理时，所得沉淀都有较深的颜色，用沉淀定容后的溶液相当混浊，会影响测量的准确度，这可能是由于酸或碱水解时对氮源营养破坏严重，不利于发酵的进行，大部分水解转化的可溶物在发酵时无法得到充分利用而残留下来，从而增大了发酵液后处理的难度。

(2)酶水解植物蛋白作为氮源。以中性蛋白酶和碱性蛋白酶进行水解试验，植物蛋白按照50 g·L-1配制水溶液，中性蛋白酶加量0.7 %(质量分数)，于pH 7.0，60 ℃，水解3.5 h；碱性蛋白酶加量0.51 %(质量分数)，于pH 8.0，60 ℃，水解5 h[7～8]。酶水解完成后，90 ℃保温20 min，使酶水解液中的酶完全灭活，然后按比例添加其他物质进行发酵，结果见图3。

如图3所示，两种氮源在用酶水解后，HA产量都比对照要高。小麦胚芽蛋白经过酶水解后，HA产量在1 g·L-1左右，与直接添加和碱水解相比，提升幅度并不大。棉籽蛋白经过酶水解后的发酵效果比较好，相比于直接添加，HA产量有了大幅提升，特别是用碱性蛋白酶水解后，发酵产量达到了1.47 g·L-1，是直接添加的两倍。

总体来说，植物氮源用酶水解后的发酵效果要优于直接添加酸或碱水解，碱性蛋白酶水解的效果比中性蛋白酶效果好，棉籽蛋白的效果又要比小麦胚芽蛋白好。因此，选择碱性蛋白酶水解的棉籽蛋白进行小罐发酵试验。

图3 酶水解植物蛋白作为氮源对透明质酸发酵的影响

3.2 30 L发酵罐中以棉籽蛋白酶解液作为氮源对透明质酸发酵的影响

以牛肉膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1作为对照氮源进行小罐发酵，发酵过程曲线见图4。棉籽蛋白粉质量浓度30 g·L-1，发酵前用碱性蛋白酶水解，水解条件同摇瓶发酵，小罐发酵过程曲线见图5。

图4 以牛肉膏和蛋白胨作为对照氮源的小罐发酵过程曲线

图5 以棉籽蛋白酶解液作为氮源的小罐发酵过程曲线

在碱性蛋白酶水解棉籽蛋白的过程中，须向水解液中不断补碱以维持pH为8.0，碱用量很大，而且酶水解开始时耗碱速率很快，而后慢慢变慢。因此可以推断，酶解之后，棉籽蛋白的成分发生了很大的变化，许多蛋白质由长链变成小的短肽，甚至直接水解成了氨基酸，兽疫链球菌对该氮源更容易利用了。该罐批的HA产量为3.08 g·L-1(见图5)，与牛肉膏蛋白胨作氮源的HA产量(见图4)相当，可见采用碱性蛋白酶水解的棉籽蛋白作为透明质酸发酵的氮源是可行的。

另外，比较图4和图5可以看出，在发酵过程中，发酵液的吸光度A600和乳酸质量浓度以及HA质量浓度曲线差不多是平行的，由此可以推断，菌体的生长和乳酸的合成是相关联的，与产物的合成也是部分关联的。在对数生长期开始后，以棉籽蛋白酶解液做氮源时的耗碱速率明显高于以牛肉膏和蛋白胨做氮源时的耗碱速率，最终累计耗碱量也要高出不少，由此推论HA产量也应该比牛肉膏和蛋白胨做氮源时要高。但是，采用棉籽蛋白酶解液作为氮源时，进入对数生长期后葡萄糖的消耗速率也明显加快，按照指数流加方式补糖，没有办法在对数生长期的中后期维持一定的糖浓度，使HA的生成受到了限制。在发酵后期，葡萄糖被迅速消耗掉，发酵第16小时葡萄糖质量浓度就下降到了10 g·L-1，之后乳酸质量浓度几乎没有变化，相应的耗碱量也不再增加，因而HA质量浓度达到2.92 g·L-1以后也几乎不再增长，17 h之后发酵液中几乎没有碳源了，不得不提前下罐。因此，提高总补糖量到100 g·L-1，其它发酵条件不变，发酵过程曲线见图6。

图6 提高补糖总量后以棉籽蛋白酶解液作为氮源的小罐发酵过程曲线

从图6可以看出，在发酵的对数生长中后期开始控制糖浓度后，乳酸的合成和耗碱仍保持较高速率，在此过程中HA在高速合成，HA浓度变化曲线也能证明这一点，在补糖结束后1 h(发酵开始后16 h)发酵液中HA浓度已达到4.6 g·L-1。补糖总量提高后，保证了发酵后期充足的碳源供应，发酵结束时HA产量高达5.94 g·L-1，发酵产量提高到之前的1.93倍。

3.3 棉籽蛋白酶解液与牛肉膏和蛋白胨作氮源时的HA发酵对比

从HA产量看，棉籽蛋白酶解液作为氮源时HA产量达到了5.94 g·L-1，这个结果并不比以牛肉膏和牛肉蛋白胨做氮源时的HA产量低[9～10]。从发酵时间看，采用棉籽蛋白酶解液作氮源时发酵时间为21～22 h，比采用牛肉膏和蛋白胨作氮源时的发酵时间一般要短4～5 h，而棉籽蛋白酶解时间也需要5 h左右，因此，两者的发酵周期基本持平。从一次发酵的原料消耗看，棉籽蛋白用量比牛肉膏和蛋白胨用量要多一倍，碳源和碱的消耗也增加了，还要额外消耗碱性蛋白酶，但是棉籽蛋白的价格远远低于牛肉膏和蛋白胨的价格，其他几种原料增加的成本也不多，因此，采用棉籽蛋白酶解液作氮源的总体原料成本还是比使用牛肉膏和蛋白胨作为氮源要低得多。

4 结论

在透明质酸摇瓶发酵试验中，植物蛋白直接添加作为氮源时，小麦胚芽蛋白和棉籽蛋白的效果较好，HA产量可达0.7 g·L-1左右；植物蛋白使用酸、碱或酶水解后作为氮源时，酶水解液的发酵效果比酸或碱水解液的效果好，碱性蛋白酶水解液的发酵效果比中性蛋白酶水解液效果好，棉籽蛋白的发酵效果又要比小麦胚芽蛋白好。在30 L发酵罐中采用碱性蛋白酶水解的棉籽蛋白做氮源进行透明质酸发酵，产量达到了5.94 g·L-1。与牛肉膏和蛋白胨相比，采用碱性蛋白酶水解的棉籽蛋白作为氮源进行透明质酸发酵，产量和发酵周期相当，但原料成本更低。