苏云金芽孢杆菌Cry2Aa型杀虫晶体蛋白的分类与构效

施茹玲 郭幼红

摘   要：通过同源建模法构建Cry2Aa型杀虫晶体蛋白16种成员的活性区空间结构，基于空間结构将其分为4类，并比较分析。结果表明，Cry2Aa的DomainⅠ非常保守，几乎完全重叠;Cry2AaⅡ、Cry2AaⅣ与其他成员的DomainⅡ存在差异;Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ与其他成员的DomainⅢ存在较大差异。研究确定了影响Cry2Aa型杀虫晶体蛋白结构差异的关键氨基酸及其关键结构片段。

关键词：苏云金芽孢菌;Cry2Aa型杀虫晶体蛋白;空间构象;构效

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性孢子细菌，在孢子形成过程中会产生杀虫晶体（Crystal，Cry）蛋白[1]。Cry2Aa是Cry蛋白中罕见的一种，具有广泛的特异性，不仅对鳞翅目害虫产生高毒性，还对双翅目害虫具有显著的杀灭作用，如黑翅伊蚊、尖音库蚊、稻纵卷叶螟和水稻二化螟[2]。在实验室条件下，陆续有Bt产生抗药性的报道[3]。在许多Cry基因中，Cry2Aa基因具有杀虫谱广、杀虫效率高的特点。经Cry2Aa蛋白与BBMV的结合试验发现，昆虫对Cry2Aa蛋白不容易产生抗性，因此，Cry2Aa应用于缓减昆虫出现抗性是很有价值的[4]。

Cry2Aa类蛋白原毒素被水解后，形成3个有活性的结构域。结构域Ⅰ由1～272个残基组成，螺旋束包含7个螺旋，参与昆虫中肠细胞膜表面孔洞的形成;结构域Ⅱ由273～473个残基组成，由3个反向平行的β-折叠组成的β-棱柱结构，参与了昆虫中肠受体的结合;结构域Ⅲ由474～633个残基组成，具有类似凝集素的三明治结构，经测定与幼虫受体结合和孔的功能有关[5]。Cry2A蛋白与Cry1A相比，结构和杀虫机制不同，很有可能成为控制昆虫产生抗药性的首选蛋白[6]。

本研究构建了Cry2Aa蛋白中16种成员的活性区空间结构。基于活性区空间结构差异，对Cry2Aa型伴孢晶体蛋白进行分类，并结合已有的活性信息探讨其构效关系，为今后各种突变体设计和克隆提供理论基础，对扩大Cry2Aa型伴孢晶体蛋白的杀虫谱、增强其杀虫毒力、延缓害虫产生抗药性等具有重要意义。

1    材料与方法

1.1  数据库、服务器与软件

美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/GenBank）蛋白质与基因序列检索比对数据库;Protein Data Bank（http：//www.rcsbi.org/pbd/home/home.do）蛋白质结构数据库;Swiss-Model（http：//swissmodel. expasy.org/）预测三级结构模型;序列比对服务器（http：/www. ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）;蛋白质分子三维结构显示分析软件PyMOL。

1.2  分析方法

1.2.1  Cry2Aa类蛋白活性区空间结构预测结果

从NCBI数据库获取Cry2Aa类蛋白的序列后，在Swiss-Model数据库分别提交Cry2Aa类蛋白序列，以已知结构的Cry2Aa（PDB登录号为1i5p）为模板进行同源建模，模拟出Cry2Aa类蛋白的三维结构模型。

1.2.2  基于二级结构组成特征的Cry2Aa分类

在蛋白质分子三维结构显示分析软件PyMOL中分别打开16个Cry2Aa类杀虫晶体蛋白成员的三级结构，读取其二级结构，基于二级结构特征进行分类。

1.2.3  不同类型Cry2Aa的结构差异和构效关系

分别选取Cry2Aa1、Cry2Aa3、Cry2Aa7、Cry2Aa14作为Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ、Cry2AaⅣ的代表，比较其一级结构、二级结构及三级结构上的差异。

2    结果与分析

2.1  基于二级结构组成特征的Cry2Aa分类

Cry2Aa类蛋白共有16个成员，对各个蛋白质进行二级结构特征描述。在此基础上，将其分为Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ、Cry2AaⅣ 4类。

Cry2AaⅠ类包括10个成员：Cry2Aa1、Cry2Aa2、Cry2Aa4、Cry2Aa5、Cry2Aa6、Cry2Aa8、Cry2Aa9、Cry2Aa10、Cry2Aa12、Cry2Aa13。

Cry2AaⅡ类包括2个成员：Cry2Aa3、Cry2Aa11。

Cry2AaⅢ类只有1个成员：Cry2Aa7。

Cry2AaⅣ类包括3个成员：Cry2Aa14、Cry2Aa15、Cry2Aa16。

2.2  不同类型Cry2Aa的二级结构分析

比较Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ和Cry2AaⅣ 4种蛋白，对各蛋白的二级结构特征进行描述，结果发现，DomainⅠ保守性较高，4种蛋白均由α0、α0a、α1、α2、α3、α4、α5、α6及α7螺旋组成。通过与Cry1Aa活性蛋白比较，发现去除由49个氨基酸残基组成的N端、α0及α0a，不影响其发挥穿孔作用[4]。DomainⅡ差异较小，仅Cry2AaⅡ与其他成员在连接β8—β9的Loop上存在差异，Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ和Cry2AaⅣ的二级结构元件完全一致。DomainⅢ也存在差异，Cry2AaⅢ与其他成员存在较大差异，仅存在β12a、β12、β15、β16和β17二级结构元件，且β17比其他成员短，而Cry2AaⅠ、Cry2AaⅡ和Cry2AaⅣ的二级结构元件完全一致。

2.3  不同类型Cry2Aa的活性区空间结构比较分析

2.3.1  DomainⅠ的结构比对

比较各类Cry2Aa的DomainⅠ，所有的α螺旋与Loop几乎完全重叠，如图1所示。

2.3.2  DomainⅡ的结构比对

比较各类Cry2Aa的DomainⅡ，其比对结果如图2所示。由图2可知，Cry2AaⅠ与Cry2AaⅢ完全重合;Cry2AaⅡ与其他成员的差异主要体现在Loopβ8—β9，表现为卷曲方式不同、长度更长，其原因是Cry2AaⅡ在第408—423位的氨基酸比其他成员多了一个F（苯丙氨酸）和P（脯氨酸）。而Cry2AaⅣ与其他成员的差异主要体现在β3和β7，其走向相同，但构象不同，原因是Cry2AaⅣ在第293位的氨基酸存在差异。

2.3.3  DomainⅢ的结构比对

比较各类Cry2Aa的DomainⅢ，其比对结果如图3所示。由图3可知，Cry2AaⅠ与Cry2AaⅣ完全重合;Cry2AaⅡ与其他成员的差异主要体现在β12a，其走向相同，但构象不同，原因是Cry2AaⅡ在第480位的氨基酸存在差异。而Cry2AaⅢ与其他成员的差异较大，原因是仅存在β12a、β12、β15、β16和β17二级结构元件。

2.4  Cry2Aa型杀虫晶体蛋白构效关系分析

杀虫晶体蛋白的毒性水平与毒素的活性浓度有关，而毒素的活性浓度又取决于蛋白质的构象和溶解度。

Cry蛋白的DomainⅠ主要负责受体结合后的中肠刷状缘膜的穿膜以及离子通道的形成;邱林等[7]研究发现，甜菜夜蛾V-ATPase subunit B为Cry2Aa杀虫蛋白的功能受体。MONGKON AUDTHO等[8]利用舞毒蛾中肠酶快速将Cry2Aa1结构域Ⅰ切断，发现该片段对害虫不产生毒性。本研究发现，Cry2Aa的DomainⅠ非常保守，几乎完全重叠。由此可推断，Cry2Aa类各蛋白的离子通道的形成作用及与钙粘蛋白的结合能力相当。

DomainⅡ是一个具有典型的“希腊钥匙”的结构。研究表明与受体的结合有关[9]。Bt蛋白对昆虫的作用与昆虫中肠上的受体有关，不同的蛋白在昆虫中肠细胞膜上的结合位点和作用机制不同。Cry2Aa14蛋白（Cry2AaⅣ类）与Cry2Aa1和Cry2Aa2蛋白（Cry2AaⅠ类）的DomainⅡ序列存在氨基酸残基差异，即W293G，且其结构差异体现在β3和β7，其走向相同，但构象不同。RAMESH S HIRE等[10-11]研究发现，Cry2Aa1、Cry2Aa2与Cry2Aa14对斜纹夜蛾和棉铃虫均具有殺虫活性，然而Cry2Aa14对斜纹夜蛾和棉铃虫表现出更高的毒性，且对致倦库蚊具有杀虫活性。由此可推测，其β3和β7的构象差异可能导致毒性差异。现有的活性信息显示，Cry2Aa3（Cry2AaⅡ类）对家蚕和舞毒蛾具有杀虫活性，而其他成员未显示此活性信息[10]。Cry2Aa3与其他成员的结构差异主要体现在Loopβ8—β9，表现在卷曲方式不同、长度更长，这可能是由于它能识别不同的受体，对不同的害虫产生不同的毒效。

DomainⅢ可能参与受体之间的相互作用，同时，也与蛋白毒性的大小具有紧密联系。Cry2Aa14蛋白（Cry2AaⅣ类）与Cry2Aa1和Cry2Aa2蛋白（Cry2AaⅠ类）相比，虽然DomainⅢ的构象完全一致，但是Cry2Aa14蛋白的DomainⅢ序列在V625A存在差异。活性信息显示，Cry2Aa14对斜纹夜蛾和棉铃虫表现出更高的毒性[10]，因此，DomainⅢ单个氨基酸的差异会显著地影响Cry蛋白的毒性水平。

[参考文献]

[1]吴洪福，郭淑元，李海涛，等.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展[J].东北农业大学学报，2009，40（2）：118-122.

[2]翁绿水，陈 芬，肖国樱.Cry2Aa基因优化设计及功能验证[J].农业生物技术学报，2013，21（11）：1 261-1 269.

[3]ROH J Y，CHOI J Y，LI M S，et al.Bacillus thuringiensis as a specific， safe， and effective tool for insect pest control[J].Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，17（4）：547-559.

[4]朱延明，郜 庭，张 凤，等.Cry2Aa9m抗虫基因植物表达载体构建及对大豆的遗传转化[J].东北农业大学学报，2013，44（1）：1-6.

[5]MORSE R J，YAMAMOTO T，STROUD R M.Structure of Cry2Aa suggests an unexpected receptor binding epitope[J].Structure，2001，9（5）：409-417.

[6]MANIKANDAN R，RAMALAKSHMI A，BALASUBRAMANI V，et al.Characterization and cloning of the Cry2Aa gene from indigenous isolates of Bacillus thuringiensis[J].Molekuliarnaia Biologiia，2015，49（4）：520-526.

[7]邱 林.甜菜夜蛾中肠Cry1Ac/Cry2Aa结合蛋白的鉴定及功能分析[D].武汉：华中农业大学，2017.

[8]AUDTHO M，VALAITIS A P，ALZATE O，et al.Production of chymotrypsin-resistant Bacillus thuringiensis Cry2Aa1 delta-endotoxin by protein engineering[J].Applied Environmental  Microbiology，1999，65（10）：4 601-4 605.

[9]PANADDA B.Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin cry4Ba and its biological implications[J].Molecular Biology，2005（348）：363-382.

[10]HIRE RAMESH S，MAKDE RAVINDRA D，DONGRE TANAJI K，et al.Expression， purification and characterization of the Cry2Aa14 toxin from Bacillus thuringiensis subsp kenyae[J].Toxicon，2009，54（4）：24-519.

[11]MANIKANDAN R，RAMALAKSHMI A，BALASUBRA-MANI V，et al.Characterization and cloning of the Cry2Aa gene from indigenous isolates of Bacillus thuringiensis[J].Molekuliarnaia Biologiia，2015，49（4）：520-526.