循环miRNA作为肺癌诊断和预后无创标志物的研究进展

杜歆玥 杨慧龄

[摘要] 肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重影响人类健康。尽管用于肺癌诊断和靶向治疗的技术取得了进步，但由于缺乏精确有效的早期检测方法，目前肺癌的诊断和预后仍然不理想，生存率较低。肺癌由多种机制参与调控，其中microRNAs（miRNAs）參与转录后进行基因表达调控并伴随着肿瘤整个发生发展的过程，近期研究发现在血清和血浆的生物体液中检测到的循环miRNA表达异常与肺癌的早期诊断及预后密切相关。本文对循环miRNA进入循环系统的途径、稳定性及其作为肺癌患者早期诊断和预后的潜在生物标志物进行了综述和讨论。

[关键词] 循环miRNA;非编码小分子miRNA;肺癌;诊断;预后

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）05（b）-0031-04

Research progress of circulating miRNA as a noninvasive marker for diagnosis and prognosis of lung cancer

DU Xinyue1，2   YANG Huiling1，2

1.Sino-American Cancer Institute， Dongguan Research Management Center， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan   523808， China; 2.School of Pharmacy， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan   523808， China

[Abstract] Lung cancer is one of the malignant tumor with the highest incidence rate and mortality rate in the world， which seriously affects human health. Despite advances in technology for lung cancer diagnosis and targeted therapy，due to the lack of accurate and effective early detection methods， the current diagnosis and prognosis of lung cancer is still not ideal， with a low survival rate. Lung cancer is regulated by a variety of mechanisms， among which microRNAs （miRNAs） participate in gene expression regulation after transcription and accompany the whole process of tumor development. Recent studies have found that abnormal expression of circulating miRNA detected in serum and plasma biological fluids is closely related to early diagnosis and prognosis of lung cancer. In this paper， the pathway， stability and potential biomarker of early diagnosis and prognosis of lung cancer are reviewed and discussed.

[Key words] Circulating miRNA; microRNA; Lung cancer; Diagnosis; Prognosis

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。2018年大约有200万新发肺癌病例，其中超过170万人死于肺癌[1-2]。有研究报道，60%以上的肺癌患者在局部晚期或转移性疾病（阶段Ⅲ或Ⅳ）时被诊断，不适于手术切除页导致预后不良，这也是造成肺癌高死亡率的原因之一[3-4]。面对肺癌的高死亡率，接受低剂量螺旋CT（LDCT）筛查的重度吸烟肺癌患者死亡率降低20%，然而由于LDCT的假阳性率高，筛查成本高和潜在的健康风险突出显示需要探索更好更精确的肺癌诊断和预后的方法[5-6]。非编码小分子RNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22～24个核苷酸的miRNA，这些分子通过负调控靶mRNA或蛋白的表达而对细胞功能具有显著的影响[7]。经研究显示，miRNA在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，如调控细胞的增殖和凋亡、细胞周期、细胞黏附、肿瘤血管的生成等[8]。与此同时，在血液及泪液、唾液、尿液、玻璃体液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液、精液、母乳和羊水等各种体液中检测到稳定存在的循环miRNA[9]。因此，循环miRNA在肺癌中扮演着不可或缺的一部分，其最重要的应用之一是可以作为非侵入性生物标志物用于肺癌的诊断和预后[7]。

1 循环miRNA的来源

理论上miRNA主要通过以下几种途径进入循环系统：①从破裂细胞被动渗漏。在正常状态下细胞内miRNA直接渗漏到循环系统并不常见，但在组织损伤或细胞凋亡及坏死的情况下却可能发生;②通过源自细胞的微囊泡的主动分泌。微囊泡是几乎所有类型的细胞在正常和病理状态下都会分泌的小囊泡，微囊泡主动分泌循环miRNA作为对各种刺激的反应，包括ATP和温度依赖性，并且类似于某些激素和细胞因子的释放[10]。③循环中的Argonaute2（AGO2）复合物可作为血浆中miRNA的重要载体。绝大多数（高达90%）的循环miRNA以非膜结合形式与AGO2相关联，AGO2是miRNA诱导的沉默复合物的效应组件，可直接结合不同的miRNA并介导细胞中的mRNA阻遏[11]。无创生物标志物AGO2复合物的免疫亲和富集可能是提高循环miRNA灵敏度和生物标志物性能的有效策略[12]。

2 循环miRNA的稳定性

大多数RNA在相对严苛的条件下容易降解，循环miRNA却可以稳定存在于体液中。循环miRNA可在室温下保持稳定24 h和经历8次反复冻融，而合成的循环miRNA与血浆一起培养时则会迅速降解。这种高稳定性是由于它们对内源和外源核糖核酸酶（RNase）活性，极端温度，极端pH（pH1或pH13），冷冻条件下的长期储存和反复冻融的抗性[13]。近期研究显示释放的囊泡在大多数血细胞的成熟和激活过程中必不可少，几乎所有与红细胞和血小板相关的miRNA都被充入循环囊泡中;另一方面，大部分以非囊泡形式存在的循环miRNA与蛋白酶敏感复合物解离后很容易被RNase降解，而这些蛋白质如AGO2、GW182、nucleophosmin1（NPM1）和高密度脂蛋白（HDL）均被确认为miRNA的载体，当从蛋白复合物中分离出AGO2时，miRNA发生降解[14]。所以这种稳定性的原因应该也与包装到微泡或者一种称作外来体的膜性脂类囊泡（例如外泌体和凋亡小体）以及核糖核蛋白复合物（例如AGO2）密切相关。

3 循环miRNA作为肺癌诊断的生物标志物

3.1 单个循环miRNA作为肺癌诊断的生物标志物

缺乏有效的早期诊断手段是导致肺癌高死亡率的主要原因之一[15]。miRNA表达在肺癌中经常失调，形成特定的表达谱，因此有利于肺癌的早期发现。最近，一项包括134个肺癌研究的系统性荟萃分析，对6919例肺癌患者和7064名对照者的分析显示循环miRNA对Ⅰ～Ⅱ期癌症的敏感度为83%，特异性为84%，并且曲线下面积（AUC）为0.90，该研究运用了大量样本进行各种亚组分析，例如种族，miRNA分析、标本、控制源、组织学类型、TNM阶段，样本量和发表年份等，更加全面地揭示了循环miRNA在早期肺癌中的诊断意义[16]。Geng等[17]研究发现血浆miRNA-20a、miRNA-145、miRNA-221在肺癌患者组与健康对照组的表达有明显差异，AUC值相对较高，具有高度特异性和敏感度，其中血浆miR-20a和miR-145在吸烟者中的检测价值要高于非吸烟者，3种循环miRNA均可作为早期肺癌诊断的肿瘤标志物。由此可见，血浆miRNA的发现将为早期准确诊断非小细胞肺癌的前景打开一扇大门，它们作为非侵入性的肿瘤特异性生物标志物，可以凭借高灵敏度和特异性将患者与健康对照者区分。除血浆外，在各种体液中均可检测到循环miRNA，血清也被广泛用于检测miRNA，血清中的miRNA在肺癌诊断中具有非常良好的诊断价值[18]。相关研究通过检测肺癌患者和正常对照者的血清发现，miR-661、miR-411、miR-181b-5p和miR-486-5p在肺癌患者血清中的表达相对正常人群明显升高，并可作为肺癌诊断的血清标志物，其联合影像学检查对肺癌的早期诊断效能明显提高[19-21]。Shi等[22]发现血清miR-15b检测早期肺癌（Ⅰ+Ⅱ期）的敏感度显著高于CEA，血清miR-22（AUC = 0.725）和miR-15b（AUC = 0.619）对肺癌的诊断意义均高于血清CEA（AUC = 0.594），具有成为肺癌筛查肿瘤标志物的潜力，可作为未来肺癌早期诊断的参考指标。

3.2 多种循环miRNA的组合作为肺癌诊断的生物标志物

通过大量文献研究显示，在不同情况下，多个循环miRNA的组合或与肿瘤标志物组合对肺癌诊断的检测更加有效。Sun等[23]对28例肺癌患者与28名健康对照者进行检测，肺癌患者的血浆miR-339-5p水平显著下调，血浆miR-21水平显著上调，miR-339-5p和miR-21的组合可以区分早期肺癌患者和健康对照者，检测效果良好，显著改善了其AUC（0.963）、灵敏度（92.9%）和特异性（92.9%）。因此，血浆miR-339-5p和miR-21的组合可能对肺癌早期诊断有显著的价值。Arab等[14]采用52例早期肺癌患者和50名健康对照者进行研究，其中发现3种循环miRNA的组合方式的敏感度和特异性比其单个miRNA更加显著，比如miR-21和miR-141组合，其AUC是0.804，敏感度为80.37%，特异性为98.10%;miR-21、miR-141和miR-328组合，其AUC是0.694，敏感度为69.14%，特异性为83.10%;miR-21、miR-141、mir-328和miR-375组合，其AUC是0.623，敏感度为61.75%，特异性为80.30%。提示循环miRNA的组合可以分别将不同种类或数量的循环miRNA组合在一起，对早期肺癌的诊断具有高度敏感度和特异性。Sromek等[24]从50名健康献血者和肺癌患者中采集血漿，血浆中miR-16、miR-205和miR-486水平显著高于健康个体，血浆miR-16、miR-205和miR-486的组合形式的检测将肺癌患者与健康人区分开并具有95%的特异性和80%的灵敏度，显著高于该研究任何单个miRNA。Halvorsen等[25]对754种microRNA的表达进行分析，筛选出6个具有明显差异表达的循环miRNA（miR-205、miR-200b、miR-125b、miR-34b、miR-429、miR-203），以6个miRNA的组合形式对肺癌Ⅰ/Ⅱ期进行检测筛查，其AUC为0.88，敏感度为85%，特异性为74%，而6个miRNA的单个AUC中最高的仅有0.83， 6种microRNA的组合显示出比单一microRNA有更高的AUC。循环miRNA以组合的形式在早期肺癌诊断中发挥了超过单个循环miRNA的生物标志物性能。Tang等[26]通过qPCR检测了62例肺癌患者和60名健康吸烟者中3种miRNA（miR-21、miR-145和miR-155）在血浆中的异常表达。这3种miRNA的组合对肺癌的诊断率很高（AUC = 0.874），敏感度和特异性分别高达69.4%和78.3%。此外，该研究还验证了这3种血浆miRNA组合不仅使肺癌患者与健康吸烟者区分，也将肺癌患者与肺良性结节的患者区分开，还具有较高的早期肺癌预后的检测性能，突出了以组合循环miRNA作为早期诊断肺癌生物标志物的优越性。

4 循環miRNA作为肺癌预后的生物标志物

目前肺功能指标、肿瘤状态以及体能状态等临床表现均被作为肺癌预后判断和治疗选择的参考因素。但肺癌的分子机制与临床表现存在一定的差异性，与肺癌相关的循环miRNA在参与肺癌发展的调控中具有预后和预测价值，更好的肺癌预后判断应纳入相关的分子资料。Su等[27]评估了100例肺癌患者和100名健康志愿者中的血浆miRNA-195水平，与健康对照组比较，血浆miRNA-195在肺癌患者中下调。血浆中低表达miRNA-195的肺癌患者的总生存期明显短于血浆中高表达miRNA-195的肺癌患者，差异表达的血浆miRNA-195是肺癌患者独立的预后指标。Xu等[28]通过196例患有肺癌肿瘤淋巴结转移（TNM）Ⅰ～Ⅲ期的患者并收集外周血样品进行分析，miR-18a、miR-20a和miR-92a的高血浆表达水平与较短的无病生存期（DFS）和总生存期（OS）相关，因此血浆miR-18a、miR-20a和miR-92a水平以及淋巴结转移是肺癌患者DFS和OS的独立危险因素，可以作为肺癌患者的新型和有希望的预后生物标志物。Sun等[29]测量了196例肺癌患者和77名健康对照者血清miR-770的表达水平，肺癌患者的血清miR-770水平明显低于健康对照组，血清miR-770表达降低与肺癌患者总体生存率低密切相关，因此，血清miR-770是肺癌患者的独立预后因素。尽管许多miRNA在组织和肿瘤细胞中表达，但它们作为生物标志物的发展需要通过侵入性方法收集组织，而不是检测外周血这种更加便捷的方法。稳定性和易检测性使循环miRNA成为用作癌症检测生物标志物的理想候选物。因此，循环miRNA可以用于早期预测肺癌患者预后，进而更有效地改善患者预后。

5 小结

肺癌在全世界范围一直都是处于高死亡率的状态，癌症的早期准确诊断和预后在降低高死亡率方面起着重要作用。miRNA调节多个基因和不同的信号通路，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，是潜在的肺癌诊断和预后的生物标志物。基于血液的循环miRNA筛选是一种新颖且至关重要的诊断和预后的工具，它在临床环境中具有创伤性微小、高稳定性、易于对人群进行大规模筛选等巨大研究优势。在不同情况下，作为早期肺癌诊断的筛选工具，多个循环miRNA的组合可能比单个miRNA更具有敏感度和特异性的指标。总之，循环miRNA作为肺癌肿瘤体液的无创伤性活体检测、早期准确诊断和预后的生物标志物，是降低肺癌高死亡率，提高患者生存率的一大革命性发现，待真正运用于临床，还需继续探索与研究。

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（收稿日期：2020-01-22  本文編辑：封   华）