小檗碱对大鼠高血压左室肥厚心肌表达miRNA-29b的影响及抑制心肌纤维化的作用机制

郑颖 李小华 李强 张忆雪 陈漠水

[摘要] 目的 探討小檗碱（BBR）对大鼠高血压左室肥厚心肌表达miRNA-29b的影响及抑制心肌纤维化的作用机制。 方法 将25只雄性SD大鼠随机分成假手术组（Sham组，n = 7），模型组（Model组，n = 9）和模型给药组（Model+BBR组，n = 9）。腹主动脉缩窄法制备大鼠高血压心肌肥厚模型，术后8周测定各组超声心动图、心脏肥大指数，Masson染色检测心肌组织纤维化，RT-PCR检测心肌组织miRNA-29b及其靶基因col1α1和col3α1 mRNA表达。 结果 Model组的舒张末期室间隔厚度（IVSd）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）均厚于Sham组，左室长轴缩短分数（FS）、射血分数（EF）均低于Sham组，差异有统计学意义（P < 0.05）;Model+BBR组的IVSd、LVPWd均薄于Model组，FS、EF均高于Model组，差异有统计学意义（P < 0.05）。Model组的心脏重量显著重于Sham组，心脏/体重比显著高于Sham组（P < 0.01）;Model+BBR组的心脏重量轻于Model组，心脏/体重比低于Model组（P < 0.05）。Model组的心肌胶原蛋白体积分数显著高于Sham组（P < 0.01）;Model+BBR组的心肌胶原蛋白体积分数低于Model组（P < 0.05）。Model组的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均高于Sham组，miRNA-29b水平低于Sham组（P < 0.05或P < 0.01）;Model+BBR组的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均低于Model组，miRNA-29b水平高于Model组（P < 0.05）。 结论 BBR可能通过下调miRNA-29b水平及上调其靶基因表达水平，抑制高血压心肌肥厚模型心肌肥厚和心肌纤维化。

[关键词] 小檗碱;心肌肥厚;心肌纤维化;miRNA-29b

[中图分类号] R-332          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）05（b）-0019-04

Effect of Berberine on the expression of miRNA-29b in left ventricular hypertrophy and the mechanism of inhibition of myocardial fibrosis

ZHENG Ying   LI Xiaohua   LI Qiang   ZHANG Yixue   CHEN Moshui

Department of Cardiology， Haikou Hospital Affiliated to Xiangya Medical College of Central South University  Haikou People′s Hospital， Hainan Province， Haikou   570208， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Berberine on expression of miRNA-29b in hypertensive left ventricular hypertrophy myocardial tissue and the mechanism of inhibition for myocardial fibrosis. Methods Male SD rats （n = 25） were randomly divided into sham operation group （sham group， n = 7）， model group （model group， n = 9） and model administration group （model+BBR group， n = 9）. Rat model of hypertensive cardiac hypertrophy was established by abdominal aortic coarctation. The cardiac structure and function were measured by echocardiography. The cardiac hypertrophy index was measured at 8 weeks postoperatively. The changes of myocardial fibrosis were detected by Masson staining. The expression of miRNA-29b and its target genes col1α1 and col3α1 mRNA in myocardial tissue were detected by RT-PCR. Results IVSd and LVPWd in model group were thicker than those in sham group， and FS and EF were lower than those in Sham group （P < 0.05）. IVSd and LVPWd of model+BBR group were thinner than those of model group， and FS and EF were higher than those of model group （P < 0.05）. Heart weight of model group was significantly heavier than that of sham group， and heart/body weight ratio was significantly higher than that of sham group （P < 0.01）. Heart weight of model+BBR group was lighter than that of model group， and the heart/body weight ratio was lower than that of model group （P < 0.05）. The volume fraction of myocardial collagen in model group was significantly higher than that in sham group （P < 0.01）. The volume fraction of myocardial collagen in model+BBR group was lower than that in model group （P < 0.05）. The level of col1α1 mRNA and col3α1 mRNA in model group was higher than those in sham group， and the level of miRNA-29b was lower than that in sham group （P < 0.05 or P < 0.01）. The level of col1α1 mRNA and col3α1 mRNA in model+BBR group was lower than those in model group， and the level of miRNA-29b was higher than that in model group （P < 0.05）. Conclusion Berberine inhibits myocardial hypertrophy and myocardial fibrosis by down-regulating miRNA-29b levels and up-regulating its target gene expression.

[Key words] Berberine; Cardiac hypertrophy; Cardiac fibrosis; miRNA-29b

高血压所致左室肥厚是心肌梗死、心力衰竭及心血管疾病总死亡率的强预测因子，逆转左室肥厚和心肌纤维化已成为高血压治疗的潜在策略之一[1]。microRNAs（miRNAs）是一种短链非编码RNA，参与以慢性后负荷增加导致的以心肌肥厚和心肌纤维化为特点的心肌重构[2]。小檗碱（BBR）可有效抑制左室肥厚及心肌纤维化，改善心功能[3]。最近研究提示，BBR可能对miRNA-29b有调控作用，干预心肌纤维化[4]。本研究通过腹主动脉缩窄法建立大鼠高血压肥厚心肌模型，探讨BBR对大鼠高血压左室肥厚心肌形成过程中心肌纤维化的预防作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性健康SD大鼠25只，体重（200±24）g，SPF级，上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。本研究经海口市人民医院生物医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

盐酸小檗碱（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：B139120）;Masson三色染液（珠海贝索生物技术有限公司，货号：BA4079B）;Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set（广州Ribobio公司，货号：miRQ0000801-1-2）。

1.3 方法

1.3.1 动物造模及分组给药

SD大鼠按随机数字表法分成三组：假手术组（Sham组，n = 7）、模型组（Model组，n = 9）和模型给药组（Model+BBR组，n = 9）。采用腹主动脉缩窄法制备高血压大鼠模型[5-7]，以10%水合氯醛腹腔麻醉，在双肾动脉上段0.5 cm处分离腹主动脉，放置直径为0.6 mm的小圆棒，用4号手术丝线将腹主动脉和小圆棒一起结扎，而后抽出小圆棒使腹主动脉缩窄。Sham组只暴露分离腹主动脉后关腹腔不做任何处理。Model+BBR组大鼠术后1周予灌胃给药，100 mg/（kg·d）。Sham组及Model组予等量生理盐水灌胃。术后8周于心尖部分取材，造模成功与否主要参考超声心动图，心肌肥大指数，心肌细胞横径明显增大，且有心肌细胞排列紊乱、细胞核增大、畸形等形态学异常，说明造模成功。造模成活大鼠共14只，其中Model组和Model+BBR组各7只。

1.3.2 观察指标

1.3.2.1 超声心动图  术后8周使用Vevo2100超声仪探测心脏，于左胸骨旁短切面获得左心室M型超声心动图，测量舒张末期室间隔厚度（IVSd）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）、左室长轴缩短分数（FS）、射血分数（EF）。

1.3.2.2 心脏肥大指数  水合氯醛麻醉，腹主动脉取血处死，迅速开胸取出心脏，用冰浴预冷生理盐水洗净残血，滤纸吸干心脏并用天平称取心脏重量，计算心脏肥大指数=心脏重量/体重×100%。

1.3.2.3 Masson染色检测心肌间质胶原沉积  采用Image-pro plus 6.0测量心肌胶原蛋白体积分数，即胶原纤维区所占观察视野的百分比，每张切片随机选取5个视野进行测量，计算其均值，作为心肌纤维化指标。

1.3.2.4 RT-PCR检测心肌组织miRNA-29b及其靶基因的表达  采用Generay公司高纯总RNA快速提取试剂盒提取心肌组织总RNA，按试剂盒说明书操作，使用qRT-PCR Primer Set检测大鼠miRNA-29b，Bulge-LoopTM miRNA primer 与miRNA 3′端结合，逆转录酶催化逆转录成cDNA，以U6 snRNA为内参照（引物序列见表1），实时荧光定量PCR仪定量miRNA-29b的表达，荧光定量PCR分析软件自动进行统计和计算，采用相对定量-△△CT法进行定量，各反应重复3次。

1.4 统计学方法

采用Graphpad Prism 5.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t方法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠超声心动图相关指标比较

Model组的IVSd、LVPWd均厚于Sham组，FS、EF均低于Sham组，差异有统计学意义（P < 0.05）;Model+BBR组的IVSd、LVPWd均薄于Model组，FS、EF均高于Model组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.2 各组大鼠心脏肥大指数相关指标比较

Model组的心脏重量显著重于Sham组，心脏/体重比显著高于Sham组（P < 0.01）;Model+BBR组的心脏重量轻于Model组，心脏/体重比低于Model组（P < 0.05）。见表3。

2.3 各组大鼠心肌纤维化情况比较

Masson染色显示血管和心肌中的胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。各组大鼠心肌纤维化情况见图1（封四）。Model组的心肌胶原蛋白体积分数显著高于Sham组（P < 0.01）;Model+BBR组的心肌胶原蛋白体积分数低于Model组（P < 0.05）。见表4。

2.4 各组大鼠心肌组织miRNA-29b及其靶基因的表达水平比较

Model組的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均高于Sham组，miRNA-29b水平低于Sham组（P < 0.05或P < 0.01）;Model+BBR组的Col1α1 mRNA和Col3α1 mRNA水平均低于Model组，miRNA-29b水平高于Model组（P < 0.05）。见图2。

3 讨论

以心脏成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积为特征的心肌纤维化也已被证明在高血压引起的心力衰竭的发病机制中起重要作用[8-9]。故延缓或逆转心肌肥厚和心肌纤维化成为治疗高血压、预防心力衰竭的潜在策略，是近年来高血压防治领域最具吸引力的治疗目标和新热点。

研究显示，miRNAs可调节心肌肥大、纤维化，对心肌肥厚的发生、发展有重要影响，是心血管疾病潜在的生物标志物和治疗靶点[10-11]。目前已明确其作用机制主要与TGF-β1/Smad信号通路[12]及肾素血管紧张素醛固酮系统介导[13]等密切相关。朱珂等[14]发现，扶正化瘀方抗心肌纤维化的作用可能与其抑制AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞增殖，并促进心脏成纤维细胞的凋亡及miRNA-29b-5p表达有关。也有学者认为，miRNA-29b通过激活Notch信号通路抑制心肌纤维化和心肌肥厚，保护心肌细胞发展为心肌梗死[15]。

BBR对压力诱导的心肌肥厚及心肌损伤有显著的治疗作用[2，16-19]，其作用机制可能与BBR通过上调心肌血管内皮细胞miRNA-29b的表达有关[20]。本实验发现8周后大鼠IVSd和LVPWd显著增加，Model+BBR组较Model组心室厚度显著减轻，提示BBR能够显著抑制心肌肥厚;大鼠心脏重量和心体比明显缩小，Masson染色发现大鼠心肌纤维化程度明显减轻，提示BBR能抑制大鼠高血压心肌肥厚和左室纤维化。故本研究采用腹主动脉缩窄法致大鼠心肌肥厚模型提示BBR可以显著抑制大鼠高血压心肌肥厚和心肌纤维化。

大鼠高血压心肌肥厚模型心肌组织miRNA-29b水平显著降低，miRNA-29b靶基因col1α1和col3α1 mRNA水平明顯增加，而BBR治疗后可以显著上调其心肌组织miRNA-29b水平，降低miRNA-29b靶基因col1α1和col3α1 mRNA水平，提示BBR的抗心肌肥厚和心肌纤维化的机制可能与其对miRNA-29b水平的调节有关。这与Zhu等[20]的研究结果基本相似。

综上所述，本研究在细胞及动物模型水平上提示了BBR对心肌肥厚的抑制作用，为心肌肥厚与纤维化疾病的治疗提供新的治疗靶点。

[参考文献]

[1]  张慧阁，郑荣果，任红欣.阿托伐他汀逆转原发性高血压患者左心室心肌肥厚临床研究[J].中国药业，2018，27（24）：71-73.

[2]  Werfel S，Leierseder S，Ruprecht B，et al. Preferential microRNA targeting revealed by in vivo competitive binding and differential Argonaute immunoprecipitation [J]. Nucleic Acids Res，2017，45（17）：10218-10228.

[3]  Liao Y，Chen K，Dong X，et al. Berberine inhibits cardiac remodeling of heart failure after myocardial infarction by reducing myocardial cell apoptosis in rats [J]. Exp Ther Med，2018，16（3）：2499-2505.

[4]  Ckv N，Macedo CT，Brr C，et al. Circulating miRNAs as potential biomarkers associated with cardiac remodeling and fibrosis in chagas disease cardiomyopathy [J]. Int J Mol Sci，2019，20（16）：E4064.

[5]  刘静，崔海峰，李思耐，等.压力负荷诱导的大鼠舒张性心力衰竭模型的改良及效果探讨[J].医学研究杂志，2017，46（1）：34-38，52.

[6]  刘成芳，刘继斌，王瑾，等.心肌内向整流钾电流激动剂扎考比利对腹主动脉缩窄大鼠心功能和心肌纤维化的作用[J].中国循环杂志，2019，34（6）：606-611.

[7]  梁悦，张光涛，汤晓萌，等.压力超负荷致心肌肥厚形成过程中收缩压和心重指数的变化[J].中国医药导报，2017， 14（14）：16-19.

[8]  Travers JG，Kamal FA，Robbins J，et al. Cardiac fibrosis：the fibroblast awakens [J]. Circ Res，2016，118（6）：1021-1040.

[9]  Kong P，Christia P，Frangogiannis NG. The pathogenesis of cardiac fibrosis [J]. Cell Mol Life Sci，2014，71（4）：549-574.

[10]  唐青，邢晓为，黄利华，等.miRNA在高血压疾病中的应用及调控机制[J].中华高血压杂志，2013，21（2）：121-126.

[11]  Moghaddam AS，Afshari JT，Esmaeili SA，et al. Cardioprotective microRNAs：lessons from stem cell-derived exosomal microRNAs to treat cardiovascular disease [J]. Atherosclerosis，2019，285：1-9.

[12]  张国华.TGF-β1/Smads信号通路在高血压心肌纤维化中的调控机制研究进展[J].山东医药，2014，54（7）：85-87.

[13]  Syed M，Ball JP，Mathis KW，et al. MicroRNA-21 ablation exacerbates aldosterone-mediated cardiac injury，remodeling，and dysfunction [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2018，315（6）：E1154-E1167.

[14]  朱珂，娄利霞，高永红，等.扶正化瘀方对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞miR-29b-5p表达的影响[J].医学综述，2019，25（13）：2689-2694.

[15]  Liu Y，Wang H，Wang X，et al. MiR-29b inhibits ventricular remodeling by activating notch signaling pathway in the rat myocardial infarction model [J]. Heart Surg Forum，2019，22（1）：E19-E23.

[16]  于怡卉，李明慧，張瑶俊，等.小檗碱对压力负荷所致心肌肥厚大鼠的保护作用[J].南京医科大学学报：自然科学版，2015，35（1）：40-45.

[17]  王小英，林佳，潘竞锵.小檗碱及同系物抑制心肌肥厚和心室重构的药理作用[J].今日药学，2012，22（1）： 46-50.

[18]  王英伟，李秀东，孙明君，等.小檗碱对力竭运动诱导的大鼠心肌损伤具有保护作用[J].中华心血管病杂志，2019， 47（8）：647-652.

[19]  Dong S，Zhang S，Chen Z，et al. Berberine could ameliorate cardiac dysfunction via interfering myocardial lipidomic profiles in the rat model of diabetic cardiomyopathy [J]. Front Physiol，2018，9：1042.

[20]  Zhu ML，Yin YL，Ping S，et al. Berberine promotes ischemia-induced angiogenesis in mice heart via upregulation of microRNA-29b [J]. Clin Exp Hypertens，2017，39（7）：672-679.

（收稿日期：2019-09-30  本文编辑：李亚聪）