CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究进展

李凤丽　石素华　李爱芹　王兴军　赵术珍

摘要：CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated protein 9）是近年发现的继ZFNs和TALENs两种基因编辑技术之后的一种新型基因组定点编辑技术。本研究分别从CRISPR/Cas9 系统的结构、类别、作用机制、相关应用以及存在问题等方面进行综述，旨在为相关领域研究提供参考。

关键词：基因组编辑;CRISPR/Cas9;sgRNA;研究进展

中图分类号：S-1：Q78文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）04-0164-09

Abstract The CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9） is a novel genomic editing technology discovered in recent years following the two gene editing technologies of ZFNs and TALENs. In this article， the structure， category， mechanism of action， application and present problems of the CRISPR/Cas9 system were summarized in order to provide references for relevant researches.

Keywords Genome editing; CRISPR/Cas9; sgRNA; Research progress

CRISPR/Cas9系统最初在细菌免疫系统中被发现，经过人为改造，可对真核细胞的基因组进行特异编辑。该系统通过特异性的单向导 RNA（single guide RNA， sgRNA）序列，引导 Cas9 蛋白特异结合到靶序列处行使 DNA 切割功能。然后利用细胞的修复机制对切割后的 DNA 进行插入、缺失或替换等修饰。相比于ZFNs和TALENs两种传统基因编辑技术，CRISPR/Cas9系统具有简单、高效和低成本等优势，在植物、动物及人类中的应用日趋广泛。因此，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术探究植物基因功能等相关问题将成为推动植物学研究的一个重要方法。

1 CRISPR/Cas系统

1.1 CRISPR系统的发现

1987年，Ishino等[1]发现大肠杆菌中负责编码碱性磷酸酶同工酶的iap基因存在特殊的重复间隔序列，但在当时并未引起广泛关注。直到2000年，人们在细菌、古细菌及线粒体基因组中发现一系列规则间隔重复序列，并命名为规则的短间隔重复序列（short regularly spaced repeats，SRSRs）。2002年，Jansen等[2]在细菌与古细菌等原核生物基因组中发现一系列新的重复序列（长度为25～37 bp），根据其重复基因座家族的结构特性，命名为规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）。同年，Makarova等[3]通過对原核生物基因组中保守基因的系统性研究，预测CRISPRs与嗜热细菌及古细菌的DNA修复系统有关。2005年，Bolotin等[4]发现在CRISPRs中，间隔区基因与噬菌体和质粒已知基因具有同源性，并提出CRISPRs结构的形成涉及cas基因介导的DNA片段化，鉴于其在细菌基因组中的稳定性和广泛性，推测它可能是细菌对抗外源DNA入侵的一种保护机制。随后有研究[5]认为，CRISPR间隔区存在于已知的噬菌体和接合质粒序列、染色体或遗传元件，且这些序列未能感染特定的间隔载体菌株，这意味着CRISPR与靶DNA的免疫有关。Makarova等[6]通过分析CRISPR和cas基因，提出CRISPR/Cas系统（CASS）是一种防御噬菌体和质粒入侵机制的假设，其功能类似于真核生物的RNA干扰（RNAi）系统。Barrangou等[7]揭示了CASS是原核生物的一种DNA修复机制，即在被病毒攻击后，细菌可以整合来自噬菌体基因组序列的新间隔区，通过去除或添加特定间隔区来改变细胞的噬菌体抗性。因此，细菌中CRISPR与相关cas基因共同通过间隔区（噬菌体序列）相似性确定抗性特异性，进而提供对噬菌体的抗性。2008年，Marraffini等[8]发现CASS干扰的靶标是DNA。2011年，Makarova等[9]通过对CRISPR/Cas系统的序列和结构进行比较，揭示Cas蛋白之间存在同源性，并首次披露CRISPR/Cas系统的分子机制。同年，Makarova等[10]进一步分析了CRISPR/Cas系统和Cas蛋白之间的进化关系，并将该系统分为三种主要类型。2013年，张锋课题组通过设计两种不同的Ⅱ型CRISPR/Cas系统来诱导人和小鼠细胞内源基因组位点的精确切割，将多个指导序列编码成单个CRISPR阵列，同时编辑了哺乳动物基因组内的几个位点，并证明RNA引导的基因编辑技术存在广泛适用性[11]。Jiang等[12]利用与双RNA复合CRISPR/Cas9，对肺炎链球菌和大肠杆菌的基因组进行精确编辑，表明该技术可应用于细菌基因组研究。

1.2 CRISPR/Cas结构基础和作用原理

CRISPR/Cas系统是大多数细菌和古细菌中存在的一种获得性免疫系统。Jansen等[13]比较了不同原核物种CRISPR基因座侧翼的四种基因（cas1～cas4），表明该类CRISPR相关基因具有同源性;cas3基因含有超家族2的解旋酶特征基序，cas4基因存在RecB核酸外切酶家族基序，可参与DNA的代谢或表达;但没有CRISPR的原核生物中不存在这些基因。因此，CRISPR和cas基因具有空间连贯性，这引起科研人员对该类基因起源及生物学功能的极大兴趣。Pourcel等[14]在鼠疫耶尔森氏菌基因组三个不同位点处发现3个CRISPR元件，其中1个具有高度多态性;对109个与三种鼠疫杆菌CRISPR相关等位基因进行测序发现，共存在29个新间隔区，且大多数属于一种株系;在9株假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）中共发现132个间隔区，仅有3个是鼠疫杆菌不同株系的共有区域。此外，他们在东方鼠疫杆菌中观察到基序缺失，但插入基序现象更为普遍，其中基序缺失发生在三个不同位点，缺失后的间隔片段在基因组的另一基因座处存在同源物;而对间隔片段进一步研究发现，它们可能是某些入侵遗传元件在细菌内的残留，可为细菌提供一种抵御外源DNA入侵的特异性免疫。该研究首次揭示了CRISPR元件中间隔片段的起源。Kunin等[15]对从195个微生物基因组中鉴定出的CRISPR重复序列进行分析发现，它们可分成多个簇，一些簇呈现稳定性，存在高度保守的RNA二级结构，而另一些则不具有保守结构域。Bhaya等[16]发现R环结构中的单DNA链是Cas3核酸酶活性的靶标，可以导致原型间隔区中的单链断裂。其具体作用机制为，在完成第一条DNA链切割后，Cas3解旋酶可能取代cascade-crRNA复合物对第二条DNA链进行切割，而靶DNA的切割干扰了病毒复制和质粒功能。

1.3 CRISPR/Cas9系统的作用原理

Bhaya等[16]于2011年得出CRISPR/Cas系统作用机制，包括①CRISPR间隔区获得：当外源基因侵入宿主时，激活CRISPR/Cas9系统并发挥免疫活性，靶向分解外源DNA序列并将原型间隔序列（protospacer）整合到宿主基因组CRISPR位点的5′端;②CRISPR表达：pre-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）从前导区转录，进一步切割成较小的crRNA，同时合成Cas9蛋白;③CRISPR干扰：crRNA和Cas9蛋白在tracrRNA的指导下形成核蛋白复合物，特异性识别外源基因并发挥核酸内切酶活性，分解外源遗传物质，赋予宿主免疫力。

1.4 CRISPR/Cas系统分布与分类

根据Cas蛋白的不同，可将CRISPR/Cas系统分为三类。类型Ⅰ含6个Cas蛋白，数量最多，也最复杂，其中Cas3蛋白最具特征性，具有解旋酶和核酸酶双重功能，在CRISPR干扰阶段发挥主要作用。Sinkunas等[17]通过对嗜热链球菌Cas3基因的克隆、表达、蛋白纯化和体外功能分析，认为其具有单链DNA刺激的ATPase活性，可与DNA/DNA和RNA/DNA双链体的解旋结构相结合，此外，Cas3的HD结构域还具有ATP非依赖性核酸酶活性，优选单链DNA作为底物。因此，该课题组提出Cas3 ATPase/解旋酶结构域充当运动蛋白，有助于将核酸酶活性传递至cascade-crRNA复合物以靶向外源DNA。类型Ⅱ主要特征是包含一个标志蛋白，即Cas9蛋白，该蛋白参与crRNA的成熟以及对入侵DNA或外源质粒进行降解[18]。类型Ⅲ包含特征性的Cas10蛋白，其具有RNA酶活性和類似于类型Ⅰ的cascade功能[19]，主要参与crRNA的成熟和剪切入侵的外源DNA。类型Ⅰ和类型Ⅲ在细菌和古细菌中均有发现，类型Ⅱ仅存在于细菌。与Ⅰ、Ⅲ相比，类型Ⅱ仅需要Cas9蛋白对DNA双链进行剪辑，Cas9蛋白则仅需要一个gRNA引导，而Ⅰ、Ⅲ依赖于复杂的蛋白质复合体及tracrRNA-crRNA的引导。

2 CRISPR/Cas9系统的应用

2.1 模式动物中的研究

CRISPR技术已成功应用于果蝇、线虫和斑马鱼等物种的基因修饰。Gratz等[20]将同源定向修复（HDR）与双链DNA（dsDNA）供体模板应用于果蝇的CRISPR/Cas9系统，通过与目标DNA序列的精确结合来促进基因组编辑的顺利进行，该过程中可以替换基因或产生条件等位基因，进而保证优化效率和特异性，最终可获得表达Cas9的转基因果蝇;将dsDNA供体和gRNA编码质粒注射到表达Cas9的果蝇中，可产生最高效率的HDR，并且可选择靶位点以避免脱靶效应。该研究为复杂的基因组修饰打开了大门，并极大地扩大CRISPR技术在果蝇研究中的应用。Zheng等[21]对弓形虫亮氨酸氨肽酶进行研究，证明其在调节游离氨基酸水平中发挥作用，可用作药物靶标的筛选。Shen等[22]通过操纵RNA引导的CRISPR/Cas9在秀丽隐杆线虫体细胞系中的表达，开发出条件性敲除方法，该技术可以在不同细胞的各个发育阶段进行条件性敲除，优于体细胞TALEN技术;而通过将该技术与活细胞成像相结合发现，在秀丽隐杆线虫的后胚胎神经细胞迁移与神经系统形成过程中存在与人类神经功能障碍相关的胚胎基因，该基因可调节肌动蛋白组织和细胞形态。Ghorbal等[23]通过破坏染色体基因并高效地产生无标记的替代单核苷酸，证明CRISPR/Cas9系统可用于恶性疟原虫的基因编辑，并阐述了基因组编辑在疟疾研究中的价值。Varshney等[24]使用CRISPR/Cas9技术，对斑马鱼的83个基因进行编辑，获得99%的突变成功率，相比于TALENs和ZFNs，该技术编辑效率显著提高，使得基因组的饱和诱变和大规模表型分析成为可能。

2.2 哺乳动物中的研究

CRISPR/Cas9系统在哺乳动物中的应用研究较多，也较为成熟。Fujii等[25]以哺乳动物受精卵为材料，利用CRISPR/Cas系统获得基因组编辑动物。Zhou等[26]利用CRISPR/Cas9系统，通过胚胎显微注射Cas9 mRNA和靶向小鼠B2m、Il2rg、Prf1、Prkdc和Rag1的多种gRNA，成功对多个基因进行编辑，并得到不同遗传修饰和种类的免疫缺陷小鼠模型。Mizuno等[27]设计并构建了Tyr基因的CRISPR/Cas9表达载体，通过EGxxFP系统证实px330-Tyr-M在Tyr基因靶位点处的DNA切割活性，还设计了用于同源定向修复基因编辑的ssDNA供体，该研究预期CRISPR/Cas9载体和任选的突变ssDNA组合，可有效地产生用于研究人类疾病的SNM诱导小鼠模型。Nakagawa等[28]构建了三种类型的CRISPR/Cas9载体，即gRNA和Cas9核酸酶、两种gRNA和Cas9切口酶以及两种gRNA和FokⅠ-dCas9，均靶向相同的基因组基因座，但不同载体对小鼠基因组的编辑具有不同特点：Cas9核酸酶导致突变率最高，出生率最低;而Cas9切口酶导致出生率最高，突变率最低;FokⅠ-dCas9导致突变率和出生率处于均衡。该研究所构建的针对两个不同基因组位点的单一一体化FokⅠ-dCas9载体成功实现了高效同时定向编辑。尽管CRISPR/Cas系统已经实现对小鼠基因进行编辑，但低成功率限制其应用。Aida等[29]通过Cas9蛋白复合物与双RNA结合使编辑小鼠的产生效率高达50%，相比之下，通过Cas9 mRNA和gRNA方法敲入小鼠频率仅为10%。Shi等[30]将CRISPR/Cas9靶向功能基因的外显子，产生更高比例的无效突变，成功在小鼠急性髓细胞白血病细胞中筛选蛋白结构域，并揭示CRISPR/Cas9基因组编辑技术应用于筛选鉴定癌症和其它疾病治疗靶点的可行性。

Zhou等[31]应用Cas9/gRNA对猪胚胎成纤维细胞中的基因进行编辑，将突变细胞集落用作供体，通过对单轮体细胞进行核移植，实现单基因和双基因的精确编辑，成功获得15个酪氨酸酶双等位基因突变纯合猪以及20个PARK2和PINK1双基因敲除纯合猪。杜氏肌营养不良症是一种隐性的X连锁形式的肌营养不良症，由肌营养不良蛋白基因控制，Chen等[32]利用CRISPR/Cas9技术靶向恒河猴肌营养不良蛋白基因，通过检测编辑效率发现，CRISPR/Cas9可使猴肌肉中87%的肌营养不良蛋白等位基因产生嵌合突变体。

2.3 人类细胞中的研究

β-地中海贫血是世界上最常见的遗传性疾病之一，是由人类血红蛋白β（HBB）基因突变引起的。Xie等[33]使用CRISPR/Cas9技术，结合piggyBac转座子，在患者中利用诱导性多能干细胞（iPSCs）可有效地纠正HBB突变，且未在校正的iPSC中检测到脱靶效应，细胞保持全能性并具有正常核型，这为干细胞基因治疗单基因疾病提供可能。有研究表明，CDK11 mRNA参与调控骨肉瘤细胞生长和存活[34]。Feng等[35]利用CRISPR/Cas9沉默CDK11基因，可导致骨肉瘤细胞系死亡，表明CRISPR-Cas9系统是修饰内源性CDK11基因表达的有效方法，同时也说明，CRISPR/Cas9靶向CDK11敲除在治疗骨肉瘤方面具有应用前景。

Nihongaki等[36]介绍了一种光活化的Cas9（paCas9），它在人胚肾293T细胞中表达过程中，通过对蓝光照射的响应，利用非同源末端连接和同源定向修复途径诱导靶向基因组序列修饰，可实现光控制CRISPR/Cas9在人类细胞中的基因编辑。Drost等[37]利用CRISPR/Cas9技术对人肠干细胞中四种最常见的结肠直肠癌基因（APC、p53、KRAS和SMAD4）进行编辑，异种植入小鼠后，四缺突变体鼠产生肿瘤，并认为APC和p53的双重缺失可导致基因组出现广泛的非整倍性，是肿瘤发生的标志。Merkle等[38]利用CRISPR/Cas9成功編辑hPSC细胞中的部分位点。Liang等[39]利用三核受精卵研究人细胞中CRISPR/Cas9介导的基因编辑，发现CRISPR/Cas9可以有效切割血红蛋白β基因，但该基因的同源定向修复效率很低，并且编辑的胚胎是嵌合体，而这些胚胎中HBB基因的修复优先以非交叉HDR途径进行。该研究进一步突出了提高CRISPR/Cas9技术的保真度和特异性的迫切需要，这是CRSIPR/Cas9介导的基因编辑在临床应用上的先决条件。Gifford等[40]利用CRISPR-Cas9技术，通过对小鼠中小儿先天性心脏病致病基因的编辑，发现只携带父本的MKL2和MYH7突变或只携带母亲NKX2突变的小鼠并没有表现出任何心脏病的迹象，而三个基因同时突变的小鼠却能显示出在患者中所观察到的心脏缺陷，这揭示了小儿先天性心脏病的致病原因。

2.4 单子叶植物中的研究

目前，CRISPR技术在单子叶模式植物水稻中的应用较为广泛。Yuan 等[41]利用CRISPR/cas9基因编辑技术，证实两个母本和三个父本印记基因对种子发育产生影响，即母本印记基因突变产生小种子，父本印记基因突变导致植株败育。Zhang等[42]研究表明，miR397能够正向调控水稻产量，进一步研究发现，miR408也能够正调控水稻产量，而其靶基因OsUCL8的CRISPR敲除或RNAi植株可表现出与miR408过表达相一致的表型。水稻东格鲁病毒病（RTD）是由水稻东格鲁杆状病毒（RTBV）和水稻东格鲁球状病毒（RTSV）复合感染引起的病害，严重影响水稻产量。RTSV抗性是由真核翻译起始因子4G （eIF4G）控制的隐性性状，传统水稻品种中的RTSV抗性可有效地降低RTD发病率。国际水稻研究所以RTSV 敏感品种IR64为材料，利用CRISPR/Cas9方法产生新的eIF4G基因突变体，在所获得的系列突变体中，只有邻近YVV的 SVLFPNLAGKS残基发生移码突变后才表现RTD抗性[43]。Ren等[44]将多个sgRNA克隆到载体中，并通过Gateway反应整合到二元载体，开发出在水稻基因组中进行CRISPR/Cas9编辑的有效位点。在水稻中，除了广泛使用的NGG PAM外，Meng等研究发现，SpCas9本身能够识别NAG PAM，在NGA PAM中SpCas9的高效率可能是其蛋白高水平表达以及sgRNA的修饰所致，也可能由于水稻转化过程中长时间组织培养的缘故，这还需要进一步验证，而进一步研究NAG PAM位点的脱靶效应，将有助于提高CRISPR/Cas9系统的编辑效率[45]。独脚金内酯是影响植株结构的关键激素，类胡萝卜素裂解双氧酶7（CCD7）是控制其生物合成的关键酶。Butt等[46]在水稻中利用CRISPR/Cas9对ccd7基因进行编辑，发现ccd7突变体分蘖数显著增加且植株变矮，而独脚金内酯的类似物GR24可以恢复这些表型。开花时间是影响水稻区域适应和产量的关键因素。OsPHL3是G2-like家族的转录因子，过表达OsPHL3的水稻开花时间延迟，利用CRISPR/Cas9对OsPHL3进行编辑的水稻则提前开花[47]。氨基酸转运蛋白（AATs）在植物发育过程的营养分配中起着不可或缺的作用。Lu等[48]发现在过表达OsAAP3的转基因水稻中，Lys、Arg、His、Asp、Ala、Gln、Gly、Thr和Tyr浓度显著升高，芽生长和分蘖均被抑制;OsAAP3的RNAi转基因植株中Arg、Lys、Asp和Thr的浓度降低，芽生长被促进，分蘖数和单株有效穗数显著增加，而利用CRISPR技术在粳稻上敲除OsAAP3，可显著提高籽粒产量。

小麦作为一种重要的粮食作物，通过科学技术提高产量、改善优良性状具有重要意义。Bhowmik等[49]将CRISPR/Cas9系统与小孢子培养技术相结合，研发出一种优化的单倍体诱变系统，用以诱导小麦基因组中的遗传编辑，并利用多个Cas9和sgRNA构建载体，对外源DsRed基因和两个内源小麦基因（TaLox2和TaUbiL1）进行精准编辑。TaGW2基因是小麦籽粒大小和千粒重的负调因子，但各成员对籽粒大小和千粒重贡献尚未明确。Wang等[50]使用CRISPR-Cas9系统和TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）分别诱变Bobwhite和Paragon品种中TaGW2基因，证实不同基因型中单拷贝无效突变会不同程度地影响籽粒大小和千粒重。最初，植物核苷酸碱基编辑仅限于将胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，直到2018年有研究[51]报道了一种改进的编辑技术。它能使原生质体中A·T转变为G·C的效率达到7.5%，再生稻和小麦植株中的转化率可达59.1%，通过引入功能进行突变可直接获得抗除草剂水稻，并且可以精确编辑所有碱基对。

目前，雖然CRISPR系统的脱靶问题尚未得到彻底解决，但简单、高效的优势使其在细菌、病毒、动物、植物中广泛应用。相信随着CRISPR系统的不断改进，该技术在今后的生物学、农学和医学领域将具有更为广阔的应用前景。

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