三七及西洋参纳米粉中皂苷类成分溶出行为研究

2020-07-04田艳申越赵翔崔海信

山东农业科学 2020年4期

田艳　申越　赵翔　崔海信

摘要：为了对三七及西洋参纳米化方法及皂苷类成分的溶出行为进行研究，为纳米技术在传统中医药领域的应用提供基础，本试验采用单因素试验筛选了三七及西洋参的纳米化方法，并进一步运用球磨法对其进行纳米化处理，研究皂苷类成分的体外溶出行为，绘制溶出曲线。结果显示，固液比值为3.125%，转速为2 000 r·min-1，研磨时间为2 h，可得到粒径为300～400 nm的纳米颗粒。三七及西洋参经过纳米化处理后，与其超微粉相比皂苷类有效成分溶出速度更快，溶出率高。三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1在60 min内的累计溶出率分别比市售三七超微粉高4.73%、11.01%、26.71%。西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1在 60 min内的累计溶出率分别比市售西洋参超微粉高14.51%、43.89%、15.93%，其中人参皂苷Re溶出效果最好。中药纳米化处理是中草药快速发展及走向现代化的一条有效途径。

关键词：三七;西洋参;纳米化;体外溶出;皂苷类

中图分类号：S567.23+6+S567.5+1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）04-0062-06

Abstract The preparation methods of Panax notoginseng and Panax quinquefolium nano-powder and the dissolution behavior of saponins were studied in the article， which could provide bases for the application of nanotechnology in the traditional Chinese medicine field. The method for preparing nano-powder of Panax notoginseng and Panax quinquefolium was screened by single factor tests. The ball milling method was further used for nanocrystallization， and the dissolution behavior of saponin components in vitro was studied to draw the dissolution curve. The results showed that the sutiable ball milling conditions were as follows： solid-liquid ratio as 3.125%， rotational speed as 2 000 r·min-1 and grinding time as 2 h， and under these conditions， the particle size could reach 300～400 nm. After nanocrystallization， the effective constituents of Panax notoginseng and Panax quinquefolium could be dissolved faster and more efficiently compared to their superfine powder. The cumulative dissolution rates of notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1 and Rb1 at 60 min were 4.73%， 11.01% and 26.71% higher than those of commercially sold Panax notoginseng ultrafine powder， respectively. The cumulative dissolution rates of ginsenoside Rg1， Re and Rb1 at 60 min were 14.51%， 43.89% and 15.93% higher than those of commercially sold Panax quinquefolium ultrafine powder， respectively， among which， the ginsenoside Re had the best dissolution effect. It indicated that nanocrystallization was an effective way for the rapid development and modernization of Chinese herbal medicine.

Keywords Panax notoginseng; Panax quinquefolium; Nanocrystallization; In vitro dissolution;Saponins

中草藥在我国有着数千年的历史，广泛应用于预防和治疗各种疾病。传统的提炼方法主要是通过溶质溶解将细胞中的主要成分提取出来，然而，传统加工方法的用药量大且提取率低，有些中药溶解性差，难溶或不溶于水，甚至难溶或不溶于有机溶剂，因此，提高中药的溶解度和溶出速度显得极为重要[1]。中药饮片粉末入药是现代临床医学中药制剂的重要工艺，几乎涵盖了所有中药品种，包括丸剂、散剂、片剂、颗粒剂、硬胶囊剂、栓剂等剂型。以粉末入药，药材粉末的分散性及均匀性使得质量便于掌控，细胞破碎后药效物质溶出率提高，不仅提高了疗效，更减少了用量，节省了资源及医疗费用，且携带与服用均较传统的煎煮方法更为方便[2]。

近年来，超微粉碎技术在中医药行业发展十分迅速，目前市场上较为常见的是超微粉碎的中草药粉末[3]。而相较于超微粉末，纳米粉具有的小粒径和大比表面积特性，更有利于有效成分的溶出。将纳米技术用于中药制剂领域是近年来的研究热点，为提高传统中药生物利用度、改善剂型落后等问题提供了新的研究思路和方法[4]。中药纳米颗粒是将中草药的有效部位或有效成分进行纳米级加工处理而得到的，中草药经过纳米化处理后，破壁率高达95%以上，粒度更加细微、均匀，得到的纳米粒子粒径越小，比表面积越大，在机体内与酶接触越充分，纳米级分子更易穿过细胞间隙，使得药物溶出率及生物利用度大大提高。中药纳米颗粒的加工方法主要有机械粉碎法、微射流法及微波法，其中机械粉碎法主要包括球磨法和气流粉碎法[5-8]。

三七为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根茎，作为一种常用的止血药，具有散瘀止血、消肿定痛的功效。西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根，补气养阴，清热生津，作为补气药常用于气虚阴亏，内热烦倦，咳喘痰血等[9]。这两种均为市场上较为常见的名贵药材，其主要生物活性成分均为皂苷类，如三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re，经常使用其粉末作为市场销售的药物类型[10，11]。刘产明等[12]研究表明，随着粉碎后药材粒径减小至10 μm以下，三七中皂苷的溶出度逐渐增加，微粉比粗粉高12.21%，比细粉高4.86%;丁苗苗等[13]发现超微粉碎可以显著提高西洋参中人参皂苷Rb1的溶出度，超微粉比粗粉高22.3%。

本试验拟运用球磨法对三七和西洋参两种药材进行纳米化处理，分别考察固液比、研磨转速、研磨时间等对颗粒大小、多分散性及皂苷类成分体外溶出行为的影响，为纳米技术在中药领域的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，组织捣碎机（JJ-2E，金坛市城西峥嵘实验仪器厂），直磨机（GS500 E，德国AEG，伊莱克斯有限公司），实验室砂磨机（VBO.30，苏州微格纳米科技有限公司），激光粒度仪（Zetasizer Nano ZS90，Malven，英国马尔文仪器有限公司），TF-FD-27冷冻干燥机（上海田枫实业有限公司），智能溶出试验仪（天津市旭阳仪器设备有限公司），高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC，1260，安捷伦科技公司），高真空镀膜仪（EM ACE600，德国徕卡显微系统（上海）贸易有限公司），扫描电子显微镜（SU8010，Hitachi，日立高新技术国际贸易有限公司）。

1.2 药品与试剂

三七药材、三七超微粉末、西洋参药材、西洋参超微粉末（北京鹤延龄药业发展有限公司，批号分别为：180197、180927、180616、180723），乙腈[色谱级，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，甲醇[色谱级，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，去离子水（PR0G0T0S2，Progard Ts2密理博纯水系统），三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Re（中国食品药品检定研究院，批号分别为110745-201017、110703-201427、110704-201521、10754-201322）。

1.3 方法

1.3.1 中草藥纳米化方法的单因素试验取三七50 g，加去离子水350 g，组织捣碎机捣碎5 min，分别取浆液50、100、150 g，加去离子水至200 g，得到固液比分别为3.125%、6.250%、9.375%的浆液，以10 000 r·min-1的转速高速剪切5 min，实验室砂磨机上样研磨，转速为1 500 r·min-1，研磨2 h，取样，使用激光粒度仪检测其粒径，研磨后的浆液经冷冻干燥制成纳米粉，以考察不同固液比对其纳米化的影响。

取三七50 g，加去离子水350 g，组织捣碎机捣碎5 min，取三份浆液均为50 g，加去离子水至200 g，以10 000 r·min-1的转速高速剪切5 min，实验室砂磨机上样研磨，分别以转速1 500、1 750、2 000 r·min-1研磨3 h，于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h取样，使用激光粒度仪检测其粒径，研磨后的浆液经冷冻干燥制成纳米粉，以考察不同转速和时间对其纳米化的影响。

1.3.2 三七及西洋参纳米粉末制备取三七及西洋参各50 g，分别加去离子水350 g，组织捣碎机捣碎5 min，取浆液50 g，加去离子水至200 g，以10 000 r·min-1的转速高速剪切5 min，实验室砂磨机上样研磨，转速为2 000 r·min-1，研磨2 h，研磨后的浆液经冷冻干燥制成纳米粉。

1.3.3 三七及西洋参皂苷类成分溶出曲线测定

（1）色谱条件

三七：色谱柱为C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，进行梯度洗脱（见表1）。流速为1.0 mL·min-1，进样量为10 μL，柱温为30℃，检测波长为203 nm[9]。

西洋参：色谱柱为C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸溶液，进行梯度洗脱（见表2）。流速为1.0 mL·min-1，进样量为20 μL，柱温为40℃，检测波长为203 nm[9]。

（2）对照品溶液制备

三七：精密称取三七皂苷R1 2.5 mg、人参皂苷Rg1 10 mg、人参皂苷Rb1 10 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，至刻度并摇匀，得对照品溶液，浓度分别为0.1、0.4、0.4 mg·mL-1。

西洋参：精密称取人参皂苷Re 10 mg、人参皂苷Rg1 2.5 mg、人参皂苷Rb1 25 mg，置于 25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，至刻度并摇匀，得对照品溶液，浓度分别为 0.4、0.1、1.0 mg·mL-1。

（3）供试品溶液制备

三七：精密称取三七纳米粉及市售三七超微粉各5 g，按《中华人民共和国药典》2015版规定，以浆法进行溶出试验，溶出介质为去离子水，转速为50 r·min-1，温度为37℃，分别于2、10、20、30、40、60 min时取样5 mL，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得供试品溶液。每次取样后及时补足等量减少的溶出介质[14]。

西洋参：精密称取西洋参纳米粉及市售西洋参超微粉各5 g，按《中华人民共和国药典》2015版规定，以浆法进行溶出试验，溶出介质为去离子水，转速为100 r·min-1，温度为37℃，分别于2、10、20、30、40、60 min时取样5 mL，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得供试品溶液。每次取样后及时补足等量减少的溶出介质。

（4）溶出曲线测定

精密吸取100 μL供试品溶液，按1.3.3（1）的色谱条件进行测定，三七粉末以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1为指标，西洋参粉末以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1为指标，考察不同时间点的累计溶出量，绘制溶出曲线。

2 结果与分析

2.1 固液比、转速及研磨时间对中草药纳米化的影响

固定研磨时的转速（2 000 r·min-1）及时间（2 h），考察固液比对中药纳米颗粒粒径的影响。结果（表3）表明，固液比越低，研磨后三七粒径越小。这是因为固液比增高后，溶液粘度增大，不利于粉末的摩擦碰撞，纳米粒子也更容易发生团聚现象，导致多分散性变差，不利于粒度检测[15]。因此，为得到粒径较小的纳米粉末，需在球磨时采用较低的固液比。

固定研磨时的固液比（3.125%），考察转速与时间对纳米颗粒粒径的影响。结果（图1）表明，随着转速的增加，颗粒间摩擦、碰撞的力度增大，研磨后三七粒径减小，但是由于颗粒变小，吸附性增強，分散性变差;随研磨时间的增加，粒径减小，但在研磨2 h后，粒径减小程度变缓。说明研磨时间达到一定程度后，药材颗粒的粒径随研磨时间延长变化不大，因此研磨时间不需过长[6]。

综合上述分析，确定制备中药纳米粉末的适宜研磨条件为：固液比 3.125%，转速2 000 r·min-1，研磨2 h。

2.2 三七及西洋参纳米粉末电镜观察结果

取三七和西洋参的超微粉、纳米粉适量，分别加水稀释至1%，进行扫描电子显微镜观察。超微粉末粒径为1～20 μm，大小分布不均（图2、图4）。纳米粉末粒径为300～400 nm，组织破碎彻底，几乎看不到组织碎片，均为细碎颗粒，有利于有效成分快速溶出;但是由于细胞壁破碎，胞内高分子充分溶出凝结成絮，团聚现象较为严重（图3、图5）。

2.3 三七及西洋参皂苷类成分溶出曲线

根据三七及西洋参纳米粉和超微粉皂苷成分在不同时间点的累计溶出率绘制溶出曲线，可以看出，三七纳米粉中皂苷成分的溶出率比市售三七超微粉高，60 min内的累计溶出率更高，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1在60 min内的累计溶出率分别比市售三七超微粉高4.73%、11.01%、26.71%（图6、图7）。西洋参纳米粉中皂苷成分的溶出率比市售西洋参超微粉高，60 min内的累计溶出率也更高，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1在 60 min内的累计溶出

率分别比市售西洋参超微粉高14.51%、43.89%、15.93%，其中人参皂苷Re溶出效果最好。

3 讨论与结论

中药纳米颗粒常采用球磨法来制备，通过物料间或物料与磨球间的碰撞、摩擦及剪切等作用使药材颗粒更细小，得到超细微的纳米粉末，然而随研磨时间的增加，药物颗粒之间团聚现象愈加严重。而苏艳丽[16]也发现超微粉碎后，三七细胞内高分子物质溶出后呈现絮状结构。

从药物学分析，药物有效成分的溶出率与其颗粒的比表面积成正比，而颗粒的比表面积与其粒径成反比，因而药物颗粒的粒径越小，其比表面积越大，药物有效成分的溶出率就越高[17]。经过纳米化处理的中草药，在细胞破裂后药材颗粒变得十分细小，药物的有效成分能够在短时间内溶出，并且由于细胞壁已经破裂，没有细胞壁的阻碍，有效成分的溶出更彻底，可以显著提高药物药效及生物利用度，减少用量[18]。

本研究通过单因素试验确定利用球磨法将中草药纳米化的适宜条件为：固液比3.125%，转速2 000 r·min-1，研磨2 h。利用该方法制备了三七及西洋参纳米粉，并比较了两种纳米粉与市售超微粉中皂苷类成分的体外溶出行为。结果显示，与超微粉相比，纳米粉的皂苷类成分溶出速度更快，部分成分溶出率更高，能够有效提高药物疗效。

纳米技术不仅为中草药生产提供了新的加工方式，且由于纳米颗粒的特性，能够提高中草药的药物特性，解决传统中草药药效低、用量大、生物利用度不高等瓶颈问题，从而改变传统用药方式以及开发新式剂型[19]。虽然纳米技术会在一定程度上增加中草药生产成本，限制纳米中草药的实际应用，但是由于纳米中草药具有许多传统中草药不具备的优势，仍将推动纳米技术在传统中草药领域不断发展[6]，且随着技术与工艺的革新，纳米技术将会在传统中医药领域得到更广阔的应用，并逐步推进中医药现代化的进程。

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