微生物学快速现场评估在支气管镜下诊断肺部感染的价值

房宇坤 李玉 王剑 陈瑾瑶 宋嘉 沈青 吴丽君 陈清勇

[摘要]目的 探討微生物学快速现场评估（M-Rose）在支气管镜下对肺部感染的诊断价值。方法 回顾性分析2018年1～8月在浙江省解放军903医院的104例均行支气管镜的肺部感染患者，每位患者支气管镜下的分泌物均进行微生物学快速现场评估，并同时将标本常规送检，检测病原学，并以送检的结果为金标准，比较M-Rose和检验科报告结果的符合率。结果 104例患者的检验科结果报告（细菌学涂片）中，有明确病原学92例，无明确病原学12例;其中革兰阳性菌55例，革兰阴性菌17例，结核3例，真菌4例，混合感染14例（其中包括1例真菌合并未明确病原菌的细菌感染）。M-Rose的评估结果中，有明确病原学94例，无明确病原学10例;其中革兰阳性菌56例，革兰阴性菌17例，结核3例，真菌5例，混合感染15例（包括1例结核合并未明确病原菌的细菌感染，1例真菌合并未明确病原菌的细菌感染）;两者的确诊率比较差异无统计学意义（P>0.05）。以检验结果为金标准，M-Rose对细菌阳性的诊断敏感度为100.00%，特异度为90.91%;对结核的诊断准确率为100.00%;对真菌的诊断敏感度为80.00%，特异度100.00%，总体诊断符合率为98.91%。M-Rose对肺部感染的诊断结果与检验科病原学结果的一致性好（Kappa=0.907，P<0.001）。结论 M-Rose在支气管镜下对肺部感染的患者有较高的诊断价值，有助于对感染患者进行病原学的初步评估，可以为未来的临床治疗提供早期的治疗依据。

[关键词]肺部感染;微生物快速评估;病原微生物;支气管镜

[中图分类号] R563          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）5（b）-0004-05

Value of microbiological rapid on-site evaluation in the diagnosis of pulmonary infection under bronchoscope

FANG Yu-kun1   LI Yu1   WANG Jian1   CHEN Jin-yao2   SONG Jia1   SHEN Qing1   WU Li-jun1   CHEN Qing-yong1▲

1. Department of Respiratory and Critical Medicine， the 903th Hospital of PLA， Zhejiang Province， Hangzhou   330000， China; 2. Department of Medical Biology， University of Sydney， Sydney   2050， Australia

[Abstract] Objective To explore the value of microbiology rapid on-site evaluation （M-Rose） in the diagnosis of pulmonary infection under bronchoscope. Methods A retrospective analysis was made on 104 patients with bronchoscopic pulmonary infection in the 903th Hospital of PLA in Zhejiang Province from January to August 2018. The secretions of each patient under bronchoscope were evaluated on the spot by microbiology， and the samples were sent to the laboratory for testing at the same time， taking the report of the laboratory as the gold standard. The results of M-Rose and laboratory report are compared. Results Among the 104 cases， 92 cases had definite etiology， 12 cases had no definite etiology， including 55 cases of Gram-positive bacteria， 17 cases of Gram-negative bacteria， 3 cases of tuberculosis， 4 cases of fungi， and 14 cases of mixed infection （including one case of fungus combined with bacterial infection of unknown etiology）. A total of 94 cases of M-Rose had definite etiology， there were 10 cases with no definite etiology， including 56 cases of Gram-positive bacteria， 17 cases of Gram-negative bacteria， 3 cases of tuberculosis， 5 cases of fungi， and 15 cases of mixed infection （including one case of tuberculosis with bacterial infection of unknown etiology， one case of fungus with bacterial infection without definite pathogen）. There was no significant difference in the diagnosis rate between the two detection methods （P>0.05）. With the test results as the gold standard， the sensitivity and specificity of M-Rose were 100.00% and 90.91% respectively. The tuberculosis diagnostic accuracy of M-Rose was 100.00%， the fungus sensitivity of M-Rose was 80.00%， the specificity was 100.00%， and the overall diagnostic accuracy was 98.91%. The results of M-Rose in the diagnosis of pulmonary infection were in good agreement with the results of etiology in the laboratory （Kappa=0.907， P<0.001）. Conclusion M-Rose has a high diagnostic value for patients with pulmonary infection under bronchoscopy， which is helpful for the preliminary evaluation of the etiology of the patients with pulmonary infection， and can provide early treatment basis for the future clinical treatment.

[Key words] Pulmonary infection; Microbiology rapid on-site evaluation; Pathogenic microorganism; Mronchoscope

肺部感染是一种由多种病原体（细菌、病毒、真菌、寄生虫等）感染引起的常见呼吸系统疾病，发病率和致死率居高不下。尤其是对于重症和老年患者，肺部感染的发生率占据首位[1-2]。在对39家医院的ICU感染患病率调查统计中发现，ICU获得性感染前三位的分别是肺部感染、血液感染和泌尿道感染[3]。所以，肺部感染是很多重症和老年患者抢救失败的重要原因，也常常让临床医生对其束手无策[4]。近年来，随着微创介入技术的快速发展和下呼吸道耐药病原菌感染的增加，在呼吸危重症患者的治疗过程中，对于病原感染微生物的迫切需求，临床上已经将介入技术如电子支气管镜、肺泡灌洗、支气管镜超声技术、电子导航超细支气管镜技术等先进手段广泛应用于肺部感染性疾病的诊断和治疗中，而微生物快速现场评估（microbiology rapid on-site evaluation，M-Rose）技术也应运而生[5-6]。M-Rose是指对于利用介入法采集的感染源标本（气道分泌物或者支气管灌洗液）进行现场制片染色，并在短时间可以根据染色结果对于感染病原得出初步诊断[7]。本研究通过回顾性分析104例肺部感染的患者，并将所有患者行支气管镜检查联合M-Rose快速评估，探讨分析M-Rose对肺部感染患者在介入支气管镜中的诊断价值。

1资料与方法

1.1一般资料

回顾性分析2018年1～8月解放军903医院呼吸内科收治并全部采用Olympus BF-260型号的支气管镜诊断为肺部感染的104例患者，其中男62例，女42例;年龄22～85岁。本研究通过医院医学伦理委员会论证并通过，研究对象知情并签署知情同意书。所有患者术前完善血常规、超敏反应蛋白、心电图、凝血全套、乙肝三项、HIV和梅毒抗体等检查。纳入标准：①确诊为肺部感染，胸部CT有渗出性病灶;②排除行支气管镜检查的禁忌。排除标准：①有活动性大咯血的患者;②严重的高血压、心律失常或者有不稳定心绞痛发作的患者;③不能纠正的出血倾向，如凝血功能严重障碍、尿毒症等患者;④严重的上腔静脉阻塞综合征。

1.2材料

快速革兰染色染色液;抗酸染色液（珠海贝索生物技术有限公司）;真菌染色液（江苏供赢联）;显微镜（Olympus CX-31型号显微镜）。

1.3术前准备

术前完善血常规、超敏反应蛋白、心电图、凝血类、乙肝三项、HIV和梅毒抗体等检查，明确有无支气管镜操作禁忌证;常规完善CT检查，并将CT数据传至虚拟导航（VBN软件）自动读入数据重建三维支气管，术前仔细研读患者胸部影像资料;告知患者術前禁食、禁水。

1.4操作过程

患者取仰卧位，鼻导管吸氧，术中时刻监测患者的生命体征;对于重症患者，予以床边支气管镜检查。经鼻或口进镜，常规支气管镜依次观察气管、隆突、双侧各级支气管，于病灶处吸引收集呼吸道分泌物。

1.5标本染色

1.5.1革兰染色  将用气管镜吸取患者气道分泌物在专用载玻片上进行薄涂（2～3次），然后进行常规的革兰染色。将标本加热固定，采用结晶紫进行初染（1 min），水洗后，采用碘液进行媒染（1 min），清水冲洗后95%乙醇脱色（20 s），最后沙黄复染（1 min），水洗印干油镜下观察。若视野中出现紫色球（杆）状细菌，则为革兰阳性球（杆）菌;若视野中出现红色球（杆）菌，则为革兰阴性菌球（杆）菌。

1.5.2抗酸染色  将用气管镜吸取的患者气道分泌物在专用载玻片上进行薄涂（2～3次），然后进行抗酸染色。将标本加热固定后，采用石碳酸复红初染（3 min，弱火），水洗后，3%盐酸乙醇脱色（20 s，2次），水洗后，亚甲蓝复染（1 min），水洗印干油镜下观察。若视野中出现红色细长，略弯曲的杆菌，则为结核杆菌。

1.5.3真菌荧光染色  将用气管镜吸取的患者气道分泌物在专用载玻片上进行薄涂（2～3次），然后进行真菌荧光染色。将荧光染料直接滴在载玻片的气道分泌物中，将其充分混匀后，盖上盖玻片，荧光镜下观察。若视野中出现荧光，则为真菌阳性。

1.6结果判读与判断

①M-Rose结果由2名经验丰富的临床微生物学医师用显微镜观察细菌的形态与数量，并记录判读结果。②M-Rose涂片结果与检验科报告的检验结果一致为阳性。③以检验科结果为金标准，M-Rose涂片结果的灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%。M-Rose涂片结果的特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%。④检验科和M-Rose涂片结果均有未明确或有多种细菌的混合性感染，且有些感染最终未能明确病原菌（最终培养及药敏实验均未能证实），为进行统计学分析，暂将未明确病原菌的感染记为阴性。

1.7统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，计数资料采用χ2检验，M-Rose和检验科报告的结果一致性采用Kappa检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1检验结果

104例患者检验科的结果报告（细菌学涂片）中，有明确病原学的患者为92例，12例未找到明确病原菌，确诊率为88.46%（92/104）。其中革兰阳性菌55例（52.88%），包括革兰阳性球菌53例，革兰阳性杆菌2例;革兰阴性菌17例（16.34%），包括革兰阴性杆菌16例，革兰阴性球菌1例;结核3例（2.88%）;真菌4例（3.84%），其中隐球菌2例，白色念珠菌1例，曲霉菌1例;混合感染14例（13.46%），包括1例真菌合并未明确病原菌的细菌感染，后者不包括在前者内，因为有1例混合感染没有明确病原菌。

2.2 M-Rose結果

104例患者的M-Rose评估结果中，有明确病原学的患者94例，10例未找到明确病原菌，确诊率为90.38%（94/104）。其中革兰阳性菌为56例（53.84%），包括革兰阳性球菌54例（涂片结果如图1），革兰阳性杆菌2例;革兰阴性菌为17例（15.38%），全部为革兰阴性杆菌（涂片结果如图2）;结核3例（2.88%）（涂片结果如图3）;真菌5例（4.81%）（涂片结果如图4），其中有隐球菌2例，白色念珠菌1例，曲霉菌2例;混合感染15例（14.42%）（1例结核合并未明确病原菌的细菌感染，1例真菌合并未明确病原菌的细菌感染）。

2.3 M-Rose组与检验科病原学诊断率的比较

检验科的病原学确诊率为88.46%，未能找到病原菌占11.54%;M-Rose的病原学确诊率为90.38%，未能找到病原菌占9.62%。两者的确诊率比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.4 M-Rose与检验结果符合情况的比较

M-Rose对肺部感染的诊断结果与检验科病原学结果表现出高度一致性（Kappa=0.907，P<0.001）。以检验结果为金标准，M-Rose对细菌阳性的诊断敏感度为100.00%（72/72），特异度为90.91%（10/11）;对结核的诊断准确率为100%（3/3）;对真菌的诊断敏感度为80.00%（4/5），特异度100.00%（4/4）。总体诊断符合率为98.91%（91/92）。

3讨论

快速现场评估（Rose）是在微创介入手术中的一种用来快速现场评估标本的方法，其可以通过快速的制片染色等方法确定标本是否为肿瘤、感染、坏死等，并指导标本下一步的分析，如活检、微生物培养或血细胞计数[8-9]。研究发现，Rose评估大大提高了诊断的准确率，减少了穿刺次数，提高了采集标本的质量[10]。临床中，肺部感染的患者病原检出率与留取痰标本的质量成正相关，由于患者的上呼吸道和口腔存在大量的正常菌群，导致收集的痰标本被污染，使病原菌检出率下降或者病原学诊断错误[11-12]。这很容易诱导临床医生误判，进而影响患者的后续治疗，也会增加耐药菌株产生的概率，导致院内感染的发生率增加，同时患者的住院时间以及治疗费用也增加。然而，通过介入技术却可以采集到可靠的感染源标本。有数据表明，支气管镜在痰菌培养中的特异性高达80%，敏感性达70%，显著优于普通留痰的精准度[13-14]。M-Rose可以将收集的分泌物进行涂片并快速镜检，很大程度地避免了标本的污染，同时也可以检验标本是否合格、是否适宜做培养以及其他染色方法。除此之外，细菌在形态学上有着天然的优势，可以直接从镜下观察细菌的形态进行判断，如球状、杆状、螺旋状等[15]。真菌和结核的特异性染色优势，对于M-Rose的判断更是如虎添翼，真菌的荧光染色阳性，这让检测人员可以直接在镜下判读部分真菌的菌属，如白色念珠菌、曲霉菌等;而结核的特异抗酸染色阳性，临床医生可以直接镜检找到结核杆菌进行诊断用药，这对于结核早期的筛查与治疗有着至关重要的意义[16]。

本研究首次将M-Rose应用于支气管镜下的肺部感染患者中，通过回顾性分析本院的104例均行支气管镜检查的肺部感染患者，结果显示，M-Rose的结果与检验科的病原学报告的确诊率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。M-Rose对肺部感染的诊断结果与检验科病原学结果的一致性好（Kappa=0.907，P<0.001）。以检验结果为金标准，M-Rose对细菌阳性的诊断敏感度为100.00%，特异度为90.91%;对结核的诊断准确率为100.00%;对真菌的诊断敏感度为80.00%，特异度为100.00%。总体诊断符合率为98.91%。这说明M-Rose在支气管镜下对肺部感染的患者有较高的诊断价值，有助于对感染患者进行病原学的初步评估，可以为下一步的临床治疗提供早期依据。

下一步的研究方向要将M-rose与C-Rose相结合，C-Rose的染色可以提供细胞分类与计数及其比例等细胞学判断，如化脓性炎症会有大量的中性粒细胞，肉芽肿性炎症为上皮样细胞与多核巨细胞，支气管哮喘则以嗜酸粒细胞和单核细胞为主，除此之外可以重复进行Rose标本取材检查，两者结合，病原微生物的判断加上细胞学分类计数，可以对重症患者的感染进行初步的估计和疗效的预判，这将对于重症肺部感染患者的治疗提供可靠的参考[17]。

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（收稿日期：2018-12-04  本文编辑：祁海文）