‘农大6号’欧李果实花色苷提取工艺优化及生物活性研究

杜灵敏 付鸿博 杜俊杰 王鹏飞 穆霄鹏 张建成

摘要：为研究‘农大6号欧李果实花色苷的生物活性，本试验对其提取工艺进行了优化，并对其抗氧化活性以及抑菌效果进行分析。结果表明，在乙醇体积分数为90%，pH=3.0，料液比为1∶ 7（g∶ mL），超声时间为30 min条件下，欧李果实花色苷提取量最高，为0.112 mg/g;欧李果实精制花色苷的DPPH·自由基清除力、FRAP还原力、·OH自由基清除力显著高于粗制花色苷;果实花色苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌有抑制效果，最小抑菌浓度分别是1 040、260、2 080 μg/mL，60℃以上高温处理后，花色苷降解速率加快，抑菌效果也会减弱。

关键词：欧李;花色苷;提取;生物活性

中图分类号：S662.3  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2020）02-0125-06

Abstract In order to research the bioactivity of anthocyanins in Cerasus humilis variety Nongda 6， the extraction technology was optimized， and their antioxidant activity and bacteriostatic action were analyzed. The results showed that the extraction content of anthocyanins was the most as 0.112 mg/g under ultrasound extraction with 90% ethanol solution at pH=3.0 and solid-to-liquid ratio as 1∶ 7 （g∶ mL） for 30 minutes. The TEAC values of DPPH·radical scavenging ability， FRAP reducing ability， and·OH radical scavenging ability of anthocyanin purification solution of Cerasus humilis were significantly higher than those of the crude extraction solution. The Cerasus humilis anthocyanins had inhibition to E. coli， Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis， and the minimum inhibitory concentrations were 1 040， 260， 2 080 μg/mL， respectively. The degradation could be accelerated and the bacteriostatic effect of anthocyanins decreased after treated at above 60℃.

Keywords Cerasus humilis; Anthocyanins; Extraction; Bioactivity

欧李（Cerasus humilis）为蔷薇科樱桃属，是我国特有的灌木果树树种之一，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁等13个省区[1]。其果实富含氨基酸、维生素、有机酸及多种矿质元素，并含有较多的花色苷、黄酮醇、黄烷醇、单宁等多酚物质，是一种具有较高营养价值的水果[2]。花色苷属于一种水溶性天然色素，安全无毒，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、增强视力等功效，是一种潜在的功能性着色剂[3-8]。随着合成色素的使用受限，各国均致力于开发天然色素以逐渐取代合成色素，因此，如何高效提取花色苷成为研究热点[9]。

花色苷是极性分子，易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂，为防止其在提取过程中降解，提取剂中需加入少量的盐酸和甲酸，同时，还会采取一些辅助方法提高提取效率。它的主要提取方法包括溶剂提取法、超临界流体萃取法、酶法提取法、高压脉冲电场辅助提取法和超声辅助提取等。溶剂提取法是使用一种或几种不溶于水的有机溶剂将目标产物选择性地从水溶性溶液中浸提[10];超临界流体萃取法作为一种新型的、最先进的物理萃取技术，可通过改变体系温度或压力参数实现对目标物的提取和分离[11];酶法提取法可使细胞壁和细胞间质结构发生局部疏松、膨胀等变化，从而增大细胞内有效成分向提取介质中扩散，提高色素提取效率[12，13];高压脉冲电场辅助提取法是一种新型的非热加工食品技术，可使自身物质的内外传质过程加速[14];超声辅助提取是利用超声波增强对提取原料的细胞壁和细胞膜的破坏作用，有助于目标产物从细胞器中溶出，从而缩短提取時间、降低能源消耗、提高花色苷提取率，具有操作简单和过程易控制等特点[15]，因而广泛应用于花色苷提取过程中。目前，科研人员对花色苷生物活性的研究主要集中在分离纯化以及抗氧化活性等方面。

本研究以‘农大6号欧李果实为材料，采用超声辅助提取花色苷，通过单因素试验、正交试验确定最优提取工艺，并对提取得到的花色苷进行抗氧化活性和抑菌作用研究，旨在评价‘农大6号欧李的生物活性。

1 材料与方法

1.1 材料

供试欧李品种为‘农大6号，于2017年8月采自山西省太谷县巨鑫试验基地。

供试大肠杆菌（E. coli）由山西农业大学园艺学院欧李团队提供;金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillus nige）均购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 主要试剂与仪器

无水乙醇、氢氧化钠和乙酸钠购自天津市化学试剂三厂，1，1-二苯基-2-苦肼基自由基、30%过氧化氢购自南京化学试剂股份有限公司，硫酸亚铁、水杨酸购自天津市北辰区方正试剂厂，以上试剂均为分析纯。

UV-5200紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器公司产品;JJ224BC型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂产品;SB25-12D超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品;HC-2518R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品;RE-2000B旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂产品;DH系列电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.3 花色苷提取工艺

1.3.1 花色苷含量 采用pH示差法测定，参考Lee等[16]的方法稍作修改。取0.025 mol/L氯化钾-盐酸缓冲液（pH=1.0）和0.4 mol/L乙酸钠-盐酸缓冲液（pH=4.5）各4.5 mL，分别加入0.5 mL提取液，摇匀、平衡15 min，于520、700 nm下测定吸光值，计算花色苷含量C（mg/g）。

式中：A11、A21分别为溶液pH=1.0时520、700 nm下的吸光值，A12、A22分别为溶液pH=4.5时520、700 nm下的吸光值;MW=449.2 g/mol;摩尔消光系数ε=26 900 L/（mol·cm）;DF为稀释倍数;L为光程（cm）;V为提取液体积（mL）;m为原料质量（g）。

1.3.2 各因素对花色苷含量的影响 在预试验基础上，利用超声辅助提取，选择酸化乙醇为提取溶剂。对超声时间、料液比、乙醇体积分数和pH值四个因素进行单因素试验，超声时间设10、20#、30、40、50 min 5个水平;料液比设1∶ 5、1∶ 6、1∶ 7、1∶ 8#、1∶ 9（g∶ mL）5个水平;乙醇体积分数设50%、60%、70%、80%、90%#5个水平;pH值设1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 5个水平。其中，当考察其它因素对花色苷含量影响时， “#”标记的因素保持恒定水平试验。重复3次。

1.3.3 花色苷提取条件的优化 根据单因素试验结果采用L9（34）正交试验设计，分别以提取乙醇体积分数（A）、料液比（B）、pH值（C）、超声时间（D）作为因素考察，并各选取三个水平进行试验，以确定最优提取条件。

1.4 花色苷制备

称取一定量的果实，液氮研磨，按照料液比1∶ 7加入体积分数为90%酸化乙醇溶液，超声提取30 min，10 000×g转速条件下离心30 min，提取2次，合并上清液得到粗提液，冷冻干燥得到粗制花色苷粉末。粗提液蒸发浓缩后通过AB-8大孔树脂吸附至饱和后先用蒸馏水洗至流出液为中性，再用乙醇洗脱，当流出液为无色时洗脱完成，收集洗脱液，经冷冻干燥得到精制花色苷粉末。

1.5 花色苷抗氧化能力测定

DPPH·自由基清除率参照文献[17]方法测定;FRAP还原力参照文献[18]方法测定;·OH清除率参照文献[19]方法测定。

1.6 花色苷抑菌能力试验

1.6.1 敏感性试验 参照蒋丽施等[20]的方法进行。分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和青霉各0.2 mL的菌液涂布于培养基上，每个培养基放置等距离的3个牛津杯，左右两边加0.1 mL花色苷提取液，中间加0.1 mL无菌水作为对照，前3种菌置于28℃、后2种菌置于37℃下培养24 h，观察抑菌效果。

1.6.2 最小抑菌浓度测定 采用二倍稀释法，将稀释的花色苷溶液加入培养基，再将稀释后的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、青霉接种于不同培养基中， 37℃恒温培养24 h，以有无抑菌圈作为判断是否为最小抑菌浓度（MIC）的标准。

1.6.3 温度处理对花色苷的抑菌效果试验 根据MIC配制花色苷溶液，分别于25、40、60、80、100℃下处理30 min，加入到对应的菌液混匀，再分别于0、2、4、6、8、12、20 h取样，测OD600值，计算抑菌率。

1.7 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0软件进行数据统计、作图和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 欧李果实花色苷提取工艺

2.1.1 单因素对花色苷含量的影响 由图1可以看出，花色苷含量随超声时间的延长表现为先上升后下降，并于30 min时达到最高值0.052 mg/g;花色苷含量在料液比为1∶ 5～1∶ 9范围内呈现先下降后略微上升的趋势，并在比值为1∶ 5时达到最大值0.053 mg/g;花色苷含量随乙醇体积分数的增加表现为先下降后上升，于乙醇体积分数90%时达到最大值0.064 mg/g;花色苷含量在pH值為3.0时最高，为0.094 mg/g。

2.1.2 欧李果实花色苷提取条件的优化 根据2.1.1中试验结果，设计正交试验（表1）。由表2可知，影响欧李花色苷提取量的因素由强到弱依次是：料液比>pH值>超声时间>乙醇体积分数，最优方案为A3B3C3D3。进一步试验验证得到该组合下花色苷的提取量为0.112 mg/g。因此，花色苷最终提取条件为乙醇体积分数90%，料液比1∶ 7（g∶ mL），pH值3.0，超声时间30 min。方差分析（表3）可知，除超声时间外，其它三个因素对花色苷提取量均有极显著影响。

2.2 欧李果实花色苷抗氧化能力

由图2看出，欧李果实粗制与精制花色苷抗氧化能力（用TEAC值表示）差异显著。精制处理花色苷清除DPPH·和·OH自由基显著高于粗制处理42.27%和3.44倍。FRAP还原力精制处理比粗制处理显著提高56.70%。

2.3 欧李果实花色苷抑菌能力

2.3.1 敏感性试验结果 图3A、3B、3C中有明显的抑菌圈出现，图3D、3E中没有抑菌圈出现。说明欧李果实花色苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑菌效果，而对黑曲霉和青霉没有抑菌效果。

2.3.2 最小抑菌浓度（MIC） 由表4可知，欧李果实花色苷对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别是1 040、2 080、260 μg/mL，对霉菌无抑制效果。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌分别是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阳性菌，说明欧李果实花色苷对细菌有广泛抑制作用。

2.3.3 温度处理对花色苷抑菌效果的影响 由图4可知，不同温度处理的欧李果实花色苷对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌短时间抑菌效果较明显， 2 h抑菌率达到最高，但随着时间的延长逐渐下降，可能是部分花色苷被破坏而失去抑菌作用。在2～20 h之间，80℃和100℃的抑菌效果明显低于25、40、60℃。说明60℃以上的高温会降低花色苷的抑菌效果。

3 讨论与结论

本研究在单因素分析的基础上，对‘农大6号欧李果实花色苷的制备进行了优化，得到各因素对花色苷提取的影响由强到弱依次为：料液比>pH值>超声时间>乙醇体积分数;最优提取工艺为乙醇体积分数90%，pH=3.0，料液比为1∶ 7，超声时间30 min，在此条件下之制备的花色苷含量为0.112 mg/g。

本研究通过对‘农大6号欧李果实花色苷进行抗氧化试验得出，精制花色苷的DPPH·、·OH自由基清除力、FRAP还原力显著高于粗制花色苷。抑菌试验显示，果实花色苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制效果，相应的最小抑菌浓度分别为1 040、260 μg/mL和2 080 μg/mL。

韩永斌等[21]认为LB培养基pH值为7.0左右时，刚加入的花色苷以二苯基苯并吡喃离子形式存在，抑菌活性最强，但随着时间的延长花色苷逆转变为其它形式，抑菌效果减弱。热处理是最常见的有效杀菌方法，可以延长货架期，该过程温度的变化能显著影响花色苷的热降解速率[22]。温度升高可使二苯基苯并吡喃向着无色的甲醇假碱和查尔酮形式转化，降解速率加快[22-24]。本试验中，温度在40℃及以下时，花色苷含量基本无变化，当增加到60℃，花色苷含量略有减小，达到80℃以上时，花色苷含量急剧降低，随着时间的延长，下降更明显，因此60℃以上的高温会降低花色苷抑菌效果。建议欧李食品的加工中，适当增加高温杀菌时间以达到延长产品保质期的目的。

参 考 文 献：

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