嗜热革节孢内切葡聚糖酶EGⅠ中精氨酸Arg7的功能分析

于伟帅 李多川

摘要：本研究将嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖酶EGⅠ中的底物结合位点精氨酸Arg7进行饱和突变，测定其性质、动力学参数的变化，以期分析精氨酸Arg7 的功能。结果表明，与原酶相比，突变酶R7A的Km有所下降，R7P的kcat显著性提高，但突变酶的kcat/Km均显著性降低。原酶的最适反应温度为50℃，突变酶R7C、R7P和R7V的则为40℃，其余突变酶的均为50℃。原酶于70℃下处理2 h具有61%的活性，相同处理条件下，突变酶R7F、R7H仍具有70%以上的活性，说明其热稳定性明显提高，R7A仅有20%的活性，剩余突变酶均有40%左右的活性。原酶的反应最适pH值为5.0，而突变酶R7C的为6.0，剩余突变酶的均为5.0。本试验探究了精氨酸Arg7饱和突变后嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖酶的性质变化，可为GH45家族进一步的分子改造和功能研究提供参考。

关键词：嗜热革节孢;内切葡聚糖酶;饱和突变;酶学性质;热稳定性

中图分类号：Q783  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2020）02-0019-08

Abstract Scytalidium thermophilium is a thermophilic fungus whose thermal stability and catalytic activity are the most important properties of industrial enzymes. In this study， the substrate binding site Arg7 in the endoglucanase EGⅠ of GH45 family was saturated mutated， and the changes of properties and kinetic parameters were analyzed. The results showed that only the Km of the mutant enzyme R7A decreased， and the kcat of the mutant enzyme R7P significantly increased， but the kcat/Km of the mutant enzyme significantly decreased compared with the wild enzyme. The optimum reaction temperature of WT was 50℃， while that of R7C， R7P and R7V was 40℃， and that of the residual mutant enzymes was 50℃. The wild enzyme still had 61% activity after treatment at 70℃ for 2 h， and the thermal stability of the mutant enzymes R7F and R7H improved significantly， and more than 70% of the activity was observed after treatment; the activity of the mutant enzyme R7A was only 20% after treated at 70℃ for 2 h， and the other mutant enzymes had about 40% of activity. The optimum pH of WT was 5.0， while the optimum pH of the mutant R7C was 6.0， and the optimum pH of the other mutant enzyme was 5.0. The above results could provide references for further molecular transformation and function study of the GH45 family.

Keywords Scytalidium thermophilium;Endoglucanase; Saturation mutation; Enzymatic properties; Thermal stability

纖维素是植物细胞壁的主要成分，是自然界中非常丰富的可再生资源。纤维素酶具有降解纤维素的能力，可将其水解成单糖，在纤维素再利用过程中起着重要作用。研究发现，纤维素的水解需要三种类型的纤维素酶协同作用：首先是内切葡聚糖酶 （endo-β-1，4-glucanases， EC 3.2.1.4）与纤维素随机结合，水解 β-1，4-糖苷键生成短链纤维素，随后外切葡聚糖苷酶 （exo-1，4-β-glucanase， EC 3.2.1.91）作用于纤维寡糖末端，切下一个纤维二糖分子，最后由β-葡萄糖苷酶 （β-1，4-glucosidases， EC 3.2.1.21） 将纤维二糖分子水解为单糖[1，2]。其中，内切葡聚糖酶广泛存在于微生物对纤维素的水解过程中[3-5]，被认为是纤维素再利用过程中的重要工业用酶，是开发最为广泛的纤维素酶产物。

根据蛋白质序列相似性和催化结构域的结构，CAZy数据库中 （http：//www.cazy.org） 内切葡聚糖酶分属于15个糖苷水解酶（GH）家族，包括GH5、GH6、GH7、GH8、GH9、GH10、GH12、GH26、GH44、GH45、GH48、GH51，GH74、GH124和GH148。与大多数糖苷水解酶家族中的酶不同，GH45家族成员仅为内切葡聚糖酶，该酶具有低分子量和高活性[6，7]。此外，Hirvonen等发现GH45内切葡聚糖酶对无定形纤维素具有更高的活性，并且在工业应用中具有很大潜力[8]，所以该酶的功能和结构研究对学术和工业领域都非常重要。GH45家族酶的主要结构特征是由六链β-barrel组成的结构域，并且具有跨越蛋白质表面的开放性底物结合槽[8]。目前，GH45家族酶的结构可细分为两组：组Ⅰ在 β-barrel 和由几个长环组成的区域之间形成底物结合槽，而组Ⅱ中酶的底物结合槽主要由 β-barrel 形成[8，9]。

嗜热革节孢（Scytalidium thermophilium） 是一种嗜热真菌，其热稳定性和催化活性是工业用酶的最重要属性。目前，除了对嗜热真菌本身进行改造以提高其生产纤维素酶的能力外，酶的工程性改造也一直是研究热点。本研究拟克隆嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖酶基因egⅠ，并将底物结合位点Arg7进行饱和突变，测定酶的性质、热稳定性、动力学参数的变化，以探究Arg7的功能和饱和突变对EGⅠ的影响，旨在为GH45家族进一步的分子改造提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

嗜热革节孢 （Scytalidium thermophilium） 菌株，由山东农业大学分子真菌学课题组筛选得到;大肠杆菌 （Escherichia coli） 菌株、質粒pPIC9K、毕赤酵母GS115，由山东农业大学微生物重点实验室保存。

1.2 主要试剂

Trans2K DNA Marker、限制性核酸内切酶和其它工具酶，以及PCR试剂盒、点突变试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司;RNA提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司;胶回收试剂盒购自Omega公司;必克隆新一代试剂盒购自南京爱必梦生物材料有限公司;二喹啉甲酸 （bicin-choninic acid， BCA） 蛋白定量试剂盒购自杭州弗德生物科技有限公司;LB培养基、YPD培养基、BMGY和BMMY培养基等，自备。

1.3 egⅠ基因的克隆

将嗜热革节孢接种到纤维素诱导培养基上，50℃培养3 d，刮取菌丝提取总RNA，反转录得到cDNA。根据嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖egⅠ的基因序列 （GenBank： HG313887.1） 设计引物，并在上下游引物中分别插入EcoRⅠ 和NotⅠ酶切位点（下划线标记）。在下游引物加入6个组氨酸 （His） 标签（波浪线标记），上下游引物序列：EGⅠ-F：5′-GCTTACGTAGAATTCGCTGATGGCAAGTCCACCCG-3′;EGⅠ-R：5′-TTAATTCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCAGGCACTGATGGTACCA-3′。PCR反应体系：cDNA 100 ng，5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，TransStart FastPfu Fly DNA 1 μL，ddH2O补足体积至50 μL。反应程序：94℃ 2 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，30个循环;72℃ 5 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收片段并保存备用。

1.4 重组质粒和突变质粒的构建

用EcoRⅠ和NotⅠ 将pPIC9K 质粒进行双酶切，根据必克隆试剂盒说明书将其和egⅠ 目的片段连接，获得重组质粒pPIC9K/egⅠ，转化大肠杆菌Trans -T1，挑单斑进行PCR验证，筛选阳性克隆并测序鉴定。

根据点突变试剂盒的要求，设计突变引物（表1）。定点突变PCR反应体系：pPIC9K/egⅠ 100 ng，5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，TransStart FastPfu Fly DNA 1 μL，ddH2O补足体积至50 μL。反应程序：94℃ 2 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 3 min，25个循环;72℃ 10 min，4℃保存。取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 剩余产物加入1 μL DMT酶，混匀，37℃处理1 h后转化大肠杆菌Trans -T1，挑单斑进行PCR验证，反应体系与反应程序同上。PCR反应阳性者测序，测序正确后提取质粒。

1.5 重组质粒和突变质粒转化、转化子筛选和表型鉴定

重组质粒和突变质粒经SalⅠ线性化酶切，酶切产物分别通过电击法转入毕赤酵母GS115，转化后在MD平板上28℃培养，待出现单斑后用G418 （1、2、3、4 mg/mL） 进行筛选、检测，获得拷贝数较高的菌株，利用通用引物3′AOX1、5′AOX1 进行PCR扩增及测序验证。

1.6 酵母工程菌的诱导表达与蛋白的分离纯化

将测序正确的两类酵母工程菌株分别接种于BMGY培养基，28℃、200 r/min培养24 h，离心并将菌体转入BMMY培养基中，28℃、200 r/min培养7 d，每隔12 h甲醇诱导一次，8 000 r/min离心获取上清液。上清液中加入硫酸铵至90%饱和并于4℃下静置过夜、离心，适量PBSA缓冲液透析，后经HisTrap HP柱纯化。纯化后酶液一部分进行SDS-PAGE检测，剩余部分进行酶性质测定。

1.7 酶性质测定

1.7.1 酶活力 采用BCA法进行蛋白浓度测定[10]，DNS法[11]测定酶活性。酶促反应体系：0.1 mg/mL纯化酶液100 μL，10 mg/mL CMC-Na溶液100 μL，0.2 mol/L HAc-NaAC缓冲液（pH=5.0） 100 μL，混匀后50℃孵育30 min，后加入300 μL DNS溶液沸水煮10 min，立即冰浴，于540 nm波长处测得吸光值，测定酶活力，计算酶的比活力。

1.7.2 酶动力学参数 配制浓度分别为4、6、8、10、12 mg/mL的CMC-Na溶液。酶促反应体系同1.7.1。根据 Lineweaver-Burk作图法，计算米氏常数 （Km）、催化常数 （kcat）及kcat/Km。

1.7.3 酶最适反应温度 取0.1 mg/mL纯化酶液100 μL、0.2 mol/L HAc-NaAC缓冲液（pH=5.0） 100 μL、10 mg/mL的CMC-Na溶液100 μL混匀，分别置于40、50、60、70、80℃下孵育30 min，测定原酶WT和突变酶在不同温度下的酶活力，以最高酶活力作为100%，其它酶活力换算为相对酶活力。

1.7.4 酶反应最适pH值 将0.1 mg/mL纯化酶液100 μL、10 mg/mL CMC-Na溶液100 μL混匀后分别加入100 μL pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.2 mol/L HAc-NaAC缓冲液，50℃下孵育30 min，测定酶活力，以最高酶活力作为100%，其它酶活力换算为相对酶活力。

1.7.5 酶热稳定性 将0.1 mg/mL纯化酶液100 μL 分别在40、50、60、70、80℃下处理2 h，加入0.2 mol/L HAc-NaAC缓冲液（pH=5.0） 100 μL、10 mg/mL的CMC-Na溶液100 μL，混匀后于50℃孵育30 min，测定酶活力，以最高酶活力作为100%，其它酶活力换算为相对酶活力。

1.8 原酶和突变酶三维结构模拟及分析

将WT和各突变酶的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL网站 （http：//swissmodel.expasy.org/） 进行三维建模，用PYMOL软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 egⅠ基因的克隆

嗜热革节孢经总RNA提取、反转录、PCR扩增后，得到约870 bp的基因片段，如图1所示，与理论值大小相符。序列测序结果表明，编码EG Ⅰ成熟肽链的序列由870个核苷酸组成，扩增得到的序列与egⅠ基因的相似度为99%。

2.2 酶的诱导表达及分离纯化

将构建好的酵母工程菌株于BMMY中培养，后将酶蛋白分离纯化，进行SDS-PAGE检测。如图2所示，试验获得了较高纯度的酶液，蛋白分子量为40 kD，较理论值 （30 kD） 稍大，推测原因是酶蛋白在异源表达过程中进行了糖基化修饰;将WT序列提交在线糖基化位点预测服务器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）进行检测，显示存在糖基化修饰。

2.3 酶性质的测定及分析

2.3.1 酶的比活力以及动力学参数分析 由表2可以看出，与WT相比，突变酶的活性均有所降低，其中R7A、R7C、R7D、R7H、R7M的比活力分别为WT的79%、57%、68%、77%、56%，其它突变酶的比活力均为WT的50%以下，而R7P、R7W仅为WT的22%、24%。Km可近似地表示酶与底物亲和力的大小，Km越小，表示亲和力越大。

与原酶相比，除R7A外各突变酶Km均有显著性增大，说明只有突变酶R7A对底物的亲和力有所提高;kcat可表示酶催化底物的能力，突变酶R7P的kcat与原酶相比有显著性提高，表明突变酶R7P提高了产物的释放效率;kcat/Km可用来衡量酶的催化效率，虽然个别突变酶的Km、kcat有所增大，但與原酶相比，突变酶的kcat/Km都显著性降低，说明突变降低了酶的催化效率，从而导致酶活性降低。

2.3.2 突变对酶最适反应温度的影响 由表3可以看出，WT 的最适反应温度为50℃，突变酶R7C、R7P和R7V 的则为40℃，其它突变酶的均为50℃。说明在一定程度上R7的突变会改变酶的最适温度。

2.3.3 突变对酶反应最适pH值的影响 由表4可知，不同酶促反应中，WT 的最适pH 值为5.0，而突变酶R7C的为6.0，其余突变酶的最适pH值均为5.0。说明R7C的突变改变了酶促反应的最适pH值，推测可能是由于突变导致活性中心的电荷分布发生变化，影响了反应的最适pH值。

2.3.4 突变对酶热稳定性的影响 由表5可以看出，WT具有较高的热稳定性，于70℃下处理2 h仍具有61.73%的活性，突变酶R7F、R7H 的热稳定性明显高于WT，相同处理条件下具有70%以上的活性，而R7A仅剩20.25%的活性，热稳定性明显下降，其它突变酶仍具有40%左右的活性。

2.4 三维建模及对比

根据Davies 等[12]1996年建立的构建WT三维模型 （PDB：1HD5）的方法，分别将剩余19种突变酶的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服务器获得三维结构模型。将WT、R7A、R7C、R7D、R7H、R7M、R7P和R7W（图3）进行比较分析可知，R7的突变使酶结构发生变化，导致酶与底物的结合发生变化，从而影响了酶的催化效率。

3 讨论与结论

Doucet等[13]利用点饱和突变技术对大肠杆菌的β-内酰胺酶Tyr105进行点饱和突变， 表明Tyr105能提高酶的底物亲和能力;Gabor等[14]对青霉素酰化酶进行点饱和突变，获得活性提高的突变子;Miyazaki等[15]对枯草芽孢杆菌蛋白酶进行点饱和突变，获得热稳定性明显提高的突变子。因此，蛋白质工程中点饱和突变技术较定点突变技术更有优势，可更大概率获得进化子。本研究中，对内切葡聚糖酶的Arg7进行饱和突变，能够更深入探究Arg7突变对酶性质和结构的影响。

研究表明，GH45家族的内切葡聚糖酶催化机理是转化底物的异头构型[12]。通过对特异腐质霉纤维二糖复合物的晶体结构进行识别，得出Asp121、Asp10分别作为催化的酸和碱，并且这两种残基是第45家族酶的所有序列中唯一完全保守的酸性残基[8，12]。Davies等[12]认为Asp121是催化质子供体，位于疏水为主的环境中，一侧是Ala73和Ala74的疏水侧链，同时它还是与Thr6的羟基相互作用的氢键的组成部分。根据R7A的三维结构模型分析，Arg7突变为丙氨酸后有可能会增加催化中心周围环境的疏水性，使活性中心与底物结合更紧密。这种酶的底物结合槽有所不同，它没有与糖作用的芳香族残基形成的通道[16]，在其底物结合槽上仅发现Trp18一个芳香族残基，而且底物结合槽内有可能存在氢键[17]。芳香族氨基酸能够参与疏水堆积表面的形成，使纤维长链更易进入催化中心[18]，而纤维素酶与纤维素的结合主要是依靠氢键和疏水作用[19]。本试验中，将Arg7 突变为芳香族氨基酸后并没有达到预期效果，活性没有提高，反而降低了酶与底物的结合能力和产物的释放效率，推测原因可能是氨基酸侧链发生了变化，从而对催化活性产生影响。

热稳定性高的纤维素酶在拓宽工业用酶的用途中非常重要。De Souza 等[20]发现热稳定性提高可以归因于更多数量的螺旋和盐桥，它们在催化核心中显示出正电荷，从而稳定三级结构。蛋白质的热稳定性主要是疏水作用、二硫键、盐桥和氢键几种力的同时作用，这些相互作用导致多肽链的灵活性降低[21，22]。GH45家族的内切葡聚糖酶中有七对二硫键，研究表明二硫键在纤维素酶的热稳定性中起着重要作用[23，24]。本研究发现，原酶具有较高的热稳定性，突变酶R7F的热稳定性提高的原因可能是突变R7F的芳香族侧链与周围的氨基酸发生疏水作用。WT 的最适反应温度和最适pH值分别为50℃和5.0。这与报道[25]的GH45家族的其余纤维素酶相似。

本研究克隆并表达了嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖酶基因egⅠ，同时对Arg7进行饱和突变并进行了酶性质测定。发现突变酶的活性较原酶均有所降低，只有突变酶R7A与底物的结合力有所提高;突变酶R7P提高了产物的释放效率;突变酶R7C、R7P和R7V的最适反应温度，R7C的最适反应pH值发生改变;在热稳定性方面，只有突变酶R7F、R7H的明显提高。本研究更深入地探究了Arg7突变对酶性质和结构的影响，可为下一步的纤维素酶研究提供参考。

参 考 文 献：

[1] Bhat M K， Bhat S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications[J]. Biotechnology Advances， 1997， 15（3/4）：583-620.

[2] Gaur R，Tiwari S. Isolation， production， purification and characterization of an organic-solvent-thermostable alkalophilic cellulase from Bacillus vallismortis RG-07[J]. BMC Biotechnology， 2015， 15：19.

[3] Béguin P， Millet J， Chauvaux S， et al. Bacterial cellulases[J]. Biochem.Soc.Trans.，1992， 20：42-46.

[4] Ohmiya Y， Takeda T， Nakamura S， et al. Purification and properties of a wall-bound endo-1，4-β-glucanase from suspension-cultured poplar cells [J]. Plant and Cell Physiology， 1995， 36（4）：607-614.

[5] Inoue T，Murashima K， Azuma J I， et al. Cellulose and xylan utilisation in the lower termite Reticulitermes speratus[J]. Journal of Insect Physiology， 1997， 43（3）：235-242.

[6] Gao J， Huang J W， Li Q， et al. Characterization and crystal structure of a thermostable glycoside hydrolase family 45 1，4-β-endoglucanase from Thielavia terrestris[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2017， 99：32-37.

[7] Couturier M，Feliu J， Haon M， et al. A thermostable GH45 endoglucanase from yeast： impact of its atypical multimodularity on activity[J]. Microbial Cell Factories， 2011， 10：103.

[8] Hirvonen M， Papageorgiou A C. Crystal structure of a family 45 endoglucanase from Melanocarpus albomyces： mechanistic implications based on the free and cellobiose-bound forms[J]. Journal of Molecular Biology， 2003， 329（3）：403-410.

[9] Nakamura A， Ishida T，Kusaka K， et al. "Newtons cradle" proton relay with amide-imidic acid tautomerization in inverting cellulase visualized by neutron crystallography[J]. Science Advances， 2015， 1：e1500263.

[10] 李海玲， 彭書明， 李凛， 等. 4种常用蛋白浓度测定方法的比较[J]. 中国生化药物杂志， 2008（4）：277-278，282.

[11] Ahmed I N， Chang R， Tsai W B. Poly（acrylic acid）nanogel as a substrate for cellulase immobilization for hydrolysis of cellulose[J]. Colloids and Surfaces B： Biointerfaces， 2017， 152：339-343.