接种比对叶菜类尾菜厌氧发酵产沼气性能影响的研究

付龙云 李彦 赵自超 张柏松 袁长波 井永苹 曲召令 王艳芹

摘要：以叶菜类尾菜为主要原料进行厌氧发酵，常因“过酸化”导致产气失败，为提高其能源化利用效率，本研究系统比较了10% 、20% 、30%和40%接种比对产沼气性能的影响。结果表明：接种比为10%和20%时，丙酸、乙酸和氨氮浓度失衡，pH值最低可至4.82和5.50，系统出现不同程度的“过酸化”现象，产气停滞或大大减少，甲烷含量低;而接种比为30%和40%时，丙酸、乙酸和氨氮浓度维持良好平衡，pH值基本维持中性，产气正常。采用较高的接种比对于叶菜类尾菜厌氧发酵正常产气至关重要，同时鉴于30%和40%接种比产气效果差别不大，从经济性角度考虑，确定30%为最佳接种比。

关键词：接种比;叶菜类尾菜;厌氧发酵;沼气;过酸化

中图分类号：S216.4  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2020）02-0075-08

Abstract Anaerobic fermentation with leafy vegetable residues as main material to produce biogas might be failed due to the superacidulation. Aimed to promote the energy utilization of leafy vegetable residues， we compared the effects of different inoculation concentrations （10%， 20%， 30% and 40%） on the biogas production performance. The results indicated that with the inoculation concentrations of 10% and 20%， the balance of propionate， acetate and ammonia nitrogen was lost， and the minimum pH value was only 4.82 and 5.50 with superacidulation， so the biogas production was poor and the methane yield was low. But with the inoculation concentrations of 30% and 40%， the balance of propionate， acetate and ammonia nitrogen was well， and the system pH was nearly neutral， so the biogas production performance was well. Therefore， higher inoculation concentration was crucial for better production performance of biogas by anaerobic fermentation with leafy vegetable residues. Considering economical efficiency， the inoculation concentration of 30% was recommended due to the similar biogas production performance between 30% and 40% of inoculation concentration.

Keywords Inoculation concentration; Leafy vegetable residues; Anaerobic fermentation; Biogas; Superacidulation

隨着市场需求的不断扩大和农业生产技术的飞速发展，近年来，我国蔬菜产业取得了长足进步，蔬菜已成为仅次于粮食的第二大类农作物。据国家统计局统计年鉴，2018年我国各类蔬菜种植面积逾2 000万公顷，年产量超7亿吨，均居于世界首位。山东、辽宁等蔬菜产业大省已形成集育种、栽培、采收、加工、运输等不同环节于一体的完整产业链，不但可供应区域内市场，而且可满足全国及国外消费者的不同需求。然而，蔬菜产业链的各环节中大量尾菜的产生难以避免，已成为影响城乡生态环保和人居环境的重要因素[1]。尾菜是指蔬菜产业各环节中产生的无商品价值的残叶、烂果、枯枝、藤蔓等农业废弃物，其总量甚至可达蔬菜产量的30%以上[2]。大量尾菜堆积在田间地头、加工厂和菜市场等场所，如果任其腐败变质、孳生蚊蝇，不但严重影响环境卫生，而且造成资源的巨大浪费。其中，白菜、莴苣、芹菜等叶菜类产生的尾菜含水量高，糖类、蛋白质等组分丰富，更难以长期储存和运输，极易腐败变质而引发固废、污水、恶臭等各种环境问题，亟需进行合理的无害化和资源化处理。目前常用的处理途径主要有饲料化、能源化、肥料化、基质化和材料化等方式[3]，其中，以厌氧沼气发酵为代表的能源化利用方式对尾菜品质要求不高，可实现对虫卵、植物病菌的高效灭杀，沼渣沼液可作为优质肥料，尤其适合在露地蔬菜、设施蔬菜等不同类型蔬菜种植密集区推广[4]。

然而，由于叶菜类尾菜自身极易被微生物分解、利用的显著特点，使得厌氧沼气发酵中易出现消化速度过快、大分子有机物迅速转化为丙酸、乙酸等挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs），超出了乙酸营养型产甲烷菌为主的沼气微生物菌群的利用能力，而在短时间内导致VFAs的超量累积，环境pH值迅速下降至沼气微生物菌群忍受阈值以下，导致产气停止，出现所谓“过酸化”现象[5，6]。该现象在以蔬菜废弃物为原料的沼气发酵工程中时有出现，常表现为有机负荷陡升引起发酵失败，其正常发酵的保持和恢复需要耗费大量的人力物力，往往需要发酵过程中投加碱性物质、更换发酵菌群等，手段繁复而效果不稳定[7]。如果在发酵初始阶段即对“过酸化”现象进行预防，稳定厌氧发酵进程，可减少中间人工干预环节，从根本上保证发酵产气的正常进行。目前常见的预防“过酸化”措施主要从底物构成、发酵工艺和接种物等角度着手，分为：使用不同物料混合发酵、新型厌氧发酵工艺和使用富含氢营养型产甲烷菌的接种物等不同方式[8-10]。但是，这些方式往往会受到原料来源、技术设备、接种物获取等方方面面的限制。而有研究发现，在厌氧发酵中采用适当的接种比亦可以有效避免“过酸化”等不良现象，取得不错的产气效果，如：陈智远等[11]研究玉米秸秆厌氧发酵时发现，提高接种量可以有效防止发酵前期偏酸，并缩短发酵启动时间;任海伟等[12]在研究不同接种量对青贮玉米秸秆与牛粪混合消化产沼气性能的影响时发现，30%的接种量相对于20%和25%的接种量，发酵时秸秆木质纤维结构破坏最严重，产气效果最好。

为促进农业废弃物沼气化合理利用，结合山东省蔬菜种植区叶菜类尾菜资源丰富的特点，本试验以收获后丢弃的白菜、芹菜和莴苣混合尾菜为原料，以猪粪厌氧发酵后的沼渣沼液为接种物，研究不同接种比对厌氧发酵产沼气性能的影响及发酵过程中丙酸、乙酸、氨氮（NH4+-N）、pH值等重要参数的变化，以避免“过酸化”不利影响和提高产沼气效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵原料为收获后丢弃的白菜、芹菜和莴苣混合尾菜，取自山东省某设施菜田，粉碎至1～2 cm颗粒。接种物为猪粪厌氧发酵后的沼渣沼液混合物。发酵物料及接种物的总固体（total solid，TS）、挥发性固体（volatile solid，VS）、总碳（total carbon，TC）、全氮（total nitrogen，TN）、碳氮比（C/N）、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）、粗蛋白（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）、粗纤维（crude fiber，CF）等理化性质见表1。

1.2 发酵装置

试验装置主要由发酵瓶、集气袋和培养箱组成。发酵瓶为2.5 L具橡胶塞玻璃瓶，橡胶塞上打双孔，分别用于发酵液采样和连接集气袋;集气袋为5 L铝箔气体采样袋（普莱特，大连）。发酵瓶、集气袋之间以玻璃弯管、橡胶管连接。发酵物料装载并混匀后，将发酵瓶和集气袋整体移入培养箱，设置温度为35℃。试验期间每天手动摇动发酵瓶两次，确保发酵物料混合均匀，并防止发酵液分层、结壳。

1.3 试验设计

试验采用中温厌氧发酵，温度35℃，运行周期30天。根据接种比（接种物与所有发酵物料的质量百分比）的不同设4个处理，即：10%、20%、30%、40%，同时设置1个只含接种物的对照，分别记为T1、T2、T3、T4和T0。每处理均设3个重复。试验各发酵瓶总装样量均为2 000 g，叶菜类尾菜统一为500 g，尾菜和接种物装入后，均以无菌水补足至2 000 g，上部留出空间为产气室。所有物料一次性装入后，充分混匀，用N2向发酵瓶内上部空间连续吹入2 min以排出空气。试验周期内每天采集气体测定产沼气量和甲烷浓度，每3天抽取发酵液测定pH值、乙酸、丙酸等化学指标。具体发酵物料组成详见表2。

1.4 指标测定

沼气产量采用湿式气体流量计（TG1，Ritter，德国）测定;甲烷含量采用气相色谱仪（GC1100，普析，北京）测定，色谱方法设置为：使用填充色谱柱（TDX-01，岛津，日本），以高纯H2为载气，用热导检测器（TCD 检测器），分别设置仪器进样口、检测器温度为110、150℃，柱箱初始温度设为40℃，保持2 min后以10℃/min升温至80℃并保持1 min;丙酸、乙酸浓度采用气相色谱仪（GC2014，岛津，日本）测定，色谱条件：使用毛细管柱（DB-WAX，安捷倫，美国），以高纯N2为载气，用氢离子火焰检测器（FID检测器），分别设置仪器进样口、检测器温度为250、300℃，柱箱程序升温，初始温度设置为110℃，保持1 min后以10℃/min升温至250℃并保持5 min;WSC采用硫酸-蒽酮比色法测定[13];氨氮、CP采用凯氏定氮仪（Kjel master K-375，BUCHI，瑞士）测定;EE按照乙醚索氏抽提法测定[14];CF采用全自动纤维分析仪（Fibertec 2010，FOSS，瑞典）测定;TC、TN采用总有机碳/有机氮分析仪（vario TOC，Elementar，德国）测定;TS、VS和pH值均按照文献[15]所述方法进行测定。

1.5 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2013和Origin 2018软件进行统计和作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理沼气日产量变化与累积产气量比较

不同接种物浓度条件下，各处理组沼气日产量情况如图1所示。30 d的试验周期，各处理组沼气日产量均呈先升高后再降低的总趋势，且均在试验开始的第一天出现一个“产气高峰”，但结合甲烷浓度分析（图3），此“产气高峰”甲烷含量很低，结合文献报道可知，此时产生的大量气体主要由尾菜细胞自身呼吸代谢、微生物分解作用等途径产生，并非进入产甲烷阶段[16，17]。发酵第2 d各组产气骤降，此后各处理组产气逐步升高，逐渐启动产甲烷发酵，进入主产气阶段：当接种比为10%时，第5 d达到产气高峰，为1.43 L/d，此后迅速降低至基本不产气;当接种比为20%时，第6 d达到产气高峰，为2.05 L/d，此后逐渐降低并在第22 d出现一个明显的次产气高峰;而接种比为30%和40%时，沼气日产量变化曲线比较接近，均在第6 d到达产气高峰，分别为2.95 L/d和3.17 L/d，此后也逐步降低，并又分别出现多个次产气高峰。多个产气高峰的出现与物料中WSC、CP、EE和CF等不同成分降解难易程度和发酵菌群适应性等因素有关[18，19]。接种比为30%和40%时产气高峰出现较多，也一定程度上说明此接种比条件下物料各成分能够得到较好利用。

由图2看出，接种比分别为10%、20%、30%和40%时，扣除完全为接种物的空白对照组T0产气量后，T1、T2、T3、T4各处理累积产气量分别为5.84、22.00、42.91、43.22 L。T1累积产气量显著较低，T2累积产气量高于T1 2.77倍，而T3和T4处理累积产气量相近且较高，分别高于T1 6.35倍和6.40倍。说明本试验条件下，接种比对产气量影响较大，采用较高的接种比能够获得更优的产气效果，但是超过一定限度则提升不大。此结果与任海伟[12]、刘荣厚[20]等的研究结论一致。

2.2 不同处理甲烷（CH4）浓度变化

试验周期内，各处理组甲烷浓度变化如图3所示。T1、T2处理组甲烷浓度变化呈现显著的先升高后降低趋势，甲烷浓度均在发酵第6 d达到最高值，分别为25.08%和37.80%，随后迅速下降。T1组在产气迅速停止的同时，甲烷浓度也逐步趋近于0;而T2组甲烷浓度则在降至约15%后，降速逐步放缓，至试验结束时为8.35%。结合文献报道和生产实践来看，低甲烷浓度的沼气缺乏利用价值，不但占用储气空间，经济性差，而且给发电、燃用、提纯等后续利用环节造成较大难度[21]。相对而言，T3和T4处理组甲烷浓度峰值较高，分别为67.21%和67.33%，分别高于T1最高值1.68倍和1.69倍，而且甲烷浓度升高后，均能够在试验周期内保持基本稳定，至试验结束时仍分别高达62.67%和63.76%，具有良好的利用价值。可见，不同接种比对叶菜类尾菜厌氧发酵所产沼气浓度影响显著，采用较高接种比时，接种物能够给发酵体系迅速带来足够的产甲烷菌群，确保甲烷的顺利产生;而采用较低的接种比则严重影响产甲烷菌群优势的建立，并将直接导致高质量沼气无法顺利获得。

2.3 不同处理pH值与丙酸、乙酸浓度变化

作为一个复杂微生物过程，厌氧沼气发酵一般分为有机串联的“大分子分解”、“脂肪酸产生”和“甲烷产生”三个重要步骤，由包含梭菌、产甲烷菌等多种功能微生物的沼气微生物菌群共同完成。其体系pH值保持一定范围的相对稳定对于维持菌群活性十分重要。有研究表明，当环境pH值低于5.0时，产甲烷菌的活性即受到完全抑制[22]。由于叶菜类尾菜可生化性好、极易被微生物分解，挥发性脂肪酸累积速度快，很容易超过产甲烷菌耐受范围而出现“过酸化”现象，因而此类原料发酵过程中pH值和挥发性脂肪酸的变化情况需要重点监控。如图4所示，接种比为10%时，发酵液pH值在发酵开始后逐步降低，至第6 d低至4.82，此后一直在5.0以下未能恢复;接种比为20%时，发酵液pH值第6 d低至5.50，此后有所恢复，但一直低于6.5;而接种比为30%和40%时，虽然发酵液pH值第6 d出现检测最低值，分别为6.02和6.15，但都能迅速恢复至7.0左右，并一直稳定在中性范围。

丙酸、乙酸均为厌氧发酵中产生的主要挥发性脂肪酸种类，是由有机物料向沼气转化过程的重要中间产物，其浓度变化不但关系到反应器运行效率，而且是判断体系是否稳定的重要标志之一[23-25]。有研究表明，过高的丙酸浓度会直接抑制产甲烷菌活动。关于丙酸抑制浓度阈值的报道各不相同，可能与原料种类、产甲烷菌类型、缓冲物质含量等诸多因素有关[26]。图5、图6展示了不同接种比条件下，发酵液中丙酸、乙酸的变化情况。与pH值变化趋势相对应的是，各处理组在试验初期，丙酸、乙酸浓度均出现快速上升过程，而高接种比条件下升幅更快，T1、T2、T3、T4处理组最高丙酸浓度分别为665.34、805.35、910.40、923.36 mg/L，最高乙酸浓度分别为742.14、1 006.08、1 303.64、1 314.42 mg/L;接种比20%、30%与40%处理组的丙酸在6 d后、乙酸在15 d后逐步下降，而10%处理组则基本维持不变。这可能是由于更多接种物虽然提供了较多的产酸微生物而产生挥发性脂肪酸，但是也能提供更多的产甲烷微生物消耗挥发性脂肪酸。

可见，高接种比条件下，虽然更多的微生物会较快地将大分子有机物分解为挥发性脂肪酸导致pH值下降，但是接种物中富含的产甲烷菌等也能更快地消耗有机酸产生甲烷，同时有更多的氨氮等缓冲物质产生，使得发酵体系pH值更加趋于中性并能保持稳定，因而更加有利于甲烷的产生。而接种物过少时，挥发性脂肪酸产生速度远超过消耗速度，导致pH值逐渐降低后难以恢复，进而对产甲烷菌群造成毒害，形成负反馈效应，引起发酵体系崩溃，产气停滞[27]。总体而言，较高的接种物含量是发酵体系pH值和挥发性脂肪酸保持动态平衡的重要保障。

2.4 不同处理氨氮浓度变化

厌氧沼气发酵过程中氨氮的产生，主要是由于蛋白质、氨基酸、尿素等含氮有机物被微生物分解所致[28]。同pH值和挥发性脂肪酸类似，氨氮浓度须稳定维持在一定范围内才能保证甲烷的顺利产生。适当浓度的氨氮不但为沼气微生物菌群的生长提供营养，而且可以对酸性物质起到良好的缓冲;氨氮过低则体系缓冲能力下降，而氨氮超量累积是厌氧发酵失衡的另一重要因素。任南琪[29]、Koster[30]等认为若氨氮浓度超过1 700 mg/L，则乙酸营养型产甲烷菌活动会受到很大抑制。本研究结果（图7）表明，试验周期内T1、T2、T3、T4处理组氨氮浓度均有所上升，各组氨氮浓度变化范围分别为：152.45～213.87、165.29～372.90、184.38～972.45、198.20～1 010.21 mg/L。可见，随接种物用量的增大，接种物中的分解菌群能够更快地将物料中的含氮有机物降解为无机态的氨氮，从而提高发酵液中的氨氮浓度。而较高的氨氮浓度又可以及时中和部分挥发性脂肪酸，升高pH值，避免“过酸化”现象的不利影响，起到保护正常厌氧发酵顺利进行的作用。同时，由于本研究中使用的发酵原料为叶菜类尾菜，蛋白质等含氮物质含量低，未观察到明显的由氨抑制引起的发酵停滞现象。

3 讨论与结论

利用集约蔬菜产区丰富的叶菜类尾菜进行厌氧发酵获取沼气和有肥料利用价值的沼渣、沼液，是实现资源高效利用、促进农业可持续发展的重要方式。然而，由于叶菜类尾菜自身原料特点，极易在發酵中出现“过酸化”现象而导致产气效率大大下降。“过酸化”现象出现的原因虽然是多方面的，但根本原因是沼气微生物菌群不足以及时消耗迅速产生的挥发性脂肪酸，导致酸过量累积和pH值骤降超出微生物耐受阈值的负反馈效应。接种物中含有数量丰富、种类多样的沼气微生物菌群，是厌氧发酵中产甲烷菌群的唯一来源，而产甲烷菌通常生长代谢较为缓慢，是厌氧沼气发酵的限速因素，其利用挥发性脂肪酸产生甲烷的效率直接决定了酸累积程度[31，32]。因此在厌氧发酵的起始阶段增加接种物用量，迅速提高产甲烷菌数量，就有可能提高系统的有机酸分解能力、促进酸碱平衡进而提高产沼气性能。Li[33]、Zhu[34]、Yang[35]等在研究不同农业废弃物厌氧沼气发酵时，均认为较高的接种比具有缩短反应器启动时间、平衡酸碱、提高系统稳定性、增加沼气产量等优势。

然而，具体到每种不同种类的农业废弃物，其最佳接种比可能存在很大不同。Lesteur等[36]研究指出，以不同物料、按不同工艺进行厌氧沼气发酵时，挥发性脂肪酸的累积情况和系统缓冲能力均有可能差异巨大，需要通过试验确定最佳接种比，才能保证产沼气潜力的正常发挥。白菜、芹菜和莴苣等在种植和采收过程中会附带产生大量的尾菜，这些尾菜含有糖类、蛋白质等营养物质，含水量高，“易分解”是其明显区别于农作物秸秆、禽畜粪便等常见农业废弃物的特征。比较而言，以叶菜类尾菜为主要原料的厌氧沼气发酵更容易受到“过酸化”现象的危害，选择合适的接种比是该类农业废弃物能源化利用的关键点之一。

氨抑制是厌氧沼气发酵中与“过酸化”相并列的另一类有害因素，高浓度的氨氮与挥发性脂肪酸一样毒害沼气微生物菌群，不利于系统酸碱平衡和产气进行。但是，氨抑制一般发生在禽畜粪便、餐厨垃圾等蛋白质含量高的物料厌氧发酵过程中[37]。叶菜类尾菜蛋白质含量较低，发酵过程中一般不会形成氨抑制，此时较高浓度的氨氮反而可以中和挥发性脂肪酸，起到平衡酸碱的积极作用。采用较高的接种比时，数量更丰富的分解菌群能够更快地水解原料产生氨氮，提高系统酸缓冲能力，有利于产甲烷菌等其它微生物生存、生长和正常发酵的进行。

本研究比较了10%、20%、30%和40%接种比条件下叶菜类尾菜厌氧发酵的情况，结果表明，不同接种比对叶菜类尾菜厌氧发酵产沼气性能影响显著。若接种比过低（10%和20%），则发酵中会出现丙酸乙酸大量累积、pH值骤降、酸碱平衡失调的“过酸化”现象，沼气菌群失活或活性降低，无法保证正常的产甲烷过程;而较高的接种比（30%和40%）能够维持发酵体系丙酸、乙酸、氨氮动态平衡和pH值相对稳定，避免发生“过酸化”现象，有利于沼气菌群正常活动，确保甲烷顺利产生。这同任海伟[12]、Li[33]、Zhu[34]、Yang[35]等的研究结果相一致。30%和40%接种比处理组最高沼气日产量分别为2.95 L和3.17 L，累积产气量分别为42.91 L和43.22 L，最高甲烷浓度分别为67.21%和67.33%，数值接近。因此，综合产气效率和经济性角度考虑，30%的接种物浓度为本试验的最佳接种比。

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