卟啉及其卟啉基聚合物光动力学的比较研究

刘长玲，杜昌明，肖 翠，宋 岩

(1.吉林化工学院 材料科学与工程学院，吉林 吉林 132022；2.中油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132022)

光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是不同于手术、放疗、化疗和免疫治疗的一种崭新疗法，对血管增生性病变组织的选择性治疗具有很好的疗效[1-5].目前，PDT已成为肿瘤防治科学中研究最为活跃的疗法之一[6].PDT的优点是适用范围广，能够同时治疗多种肿瘤，毒副作用低、生物相容性好，治疗48～72 h即可出现疗效，并且发病率低.[7-8]卟啉作为PDT的一种光敏剂，能够选择性的滞留在肿瘤组织内，在相应波长的光照射下，由基态跃迁到激发态，与周围的分子氧发生光化学反应，产生的单线态氧(1O2)能够破坏肿瘤细胞中的蛋白、脂质、核酸等重要的生物大分子，导致肿瘤细胞坏死凋亡，达到治疗目的[9-10].

因此，对5-(4-羟基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉及其卟啉基聚合物的光动力学疗法进行比较研究，利用MTT法研究三种卟啉化合物对小鼠成纤维细胞(L929细胞)和人宫颈癌细胞(HeLa细胞)的暗毒性和光毒性.

1 实验部分

5-(4-羟基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉(Por)、卟啉端基化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)(Por-PNIPAM)、卟啉端基化的聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚(寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)共聚物(Por-PNIPAM-b-POEGMA)已制备.

MTT(噻唑兰)溶液的制备：称取0.5 g的MTT，将其溶于100 mL的缓冲溶液(PBS)或无酚红的培养基中，再用0.22 μm的滤膜过滤除菌，配制成浓度为5 mg/mL的MTT溶液，并在4 ℃下避光保存.

胎牛血清(FBS)的灭活：取一瓶血清在室温下融化，再取一个相同体积的试剂瓶，瓶内装满凉水，静置30～60 min，当两个试剂瓶温度接近时，同时放入到56 ℃的水浴中灭活1 h，随后冷却至室温，再以100 mL/瓶进行分装，在-20 ℃下贮存.

胰蛋白酶溶液的制备：取0.25 g的胰蛋白酶，加入到100 mL PBS中，充分搅拌溶解，静置1.5 h后，在冰箱中放置一夜，用0.22 μm的滤膜过滤，除去细菌，在-20 ℃下保存备用.

2 结果与讨论

2.1 卟啉及其卟啉聚合物的生物相容性

采用MTT法测试了不同浓度的Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA水溶液对L929以及HeLa的暗毒性.测试结果如图1和图2所示.

Concentration(mg/mL)图1 Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA对小鼠成纤维细胞L929的暗毒性

Concentration(mg/mL)图2 Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA对人宫颈癌细胞HeLa的暗毒性

图1是Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA对L929的暗毒性，结果表明卟啉化合物的浓度在0.05～0.25 mg/mL范围内，随着浓度的增大，细胞的存活率仍然很高，即使浓度高达0.25 mg/mL时，Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA对L929细胞存活率也接近100%，说明在非光照的条件下它们对L929细胞几乎没有毒性.

图2为Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA在没有光照射的情况下对HeLa细胞活性的影响，测试结果显示了对于HeLa细胞的毒性也较低，细胞存活率都在90%以上，这说明了它们在黑暗的环境下，无论是人体正常的L929细胞，还是HeLa癌细胞的生物学相容性都很好.

2.2 卟啉及其卟啉聚合物的光毒性

同样采用MTT法在5 W红光照射下对L929和HeLa细胞毒性进行了测试.图3为Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA水溶液处理的L929细胞的光毒性.从图中可以看出，经Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA处理的L929细胞的存活率降低，与Por、Por-PNIPAM相比，Por-PNIPAM-b-POEGMA处理的L929细胞的存活率相对较低.原因可能是Por、Por-PNIPAM在37 ℃的水溶液中易发生π-π堆叠而淬灭导致细胞的光毒性降低.

Concentration(mg/mL)图3 Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA对L929细胞的光毒性

Concentration(mg/mL)图4 Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA对HeLa细胞的光毒性

图4是Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA在光照的情况下对HeLa细胞活性的影响.从图4可以得出，经Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA处理的HeLa细胞的存活率较低，尤其Por-PNIPAM-b-POEGMA对于HeLa细胞的存活率降低至30%左右，Por-PNIPAM-b-POEGMA水溶液与Por、Por-PNIPAM相比较少发生淬灭，如图5卟啉基聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA在光照条件下，对正常细胞L929和HeLa癌细胞的存活率进行比较，结果可知经过处理后L929的存活率仅降至70%，对HeLa癌细胞的存活率可降至30%左右，由此可见其对HeLa细胞的光毒性更大，而对正常细胞光毒性较小.

Concentration(mg/mL)图5 Por-PNIPAM-b-POEGMA(Mn,GPC=5 900)对L929、HeLa细胞的光毒性

图6(a)是在红光照射的条件下，L929细胞在聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA水溶液中的光学照片，从图中可以看出，大部分细胞贴壁生长，只有少量细胞死亡.图6(b)是在可见光照射条件下，癌细胞(Hela细胞)在聚合物水溶液中的光学照片.

(a) L929细胞

(b) HeLa细胞图6 细胞在聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA(Mn,GPC=5 900)水溶液(0.2 mg·mL-1)中的光学照片

从图中可以看出，细胞干瘪，几乎全部死亡.这说明在光照的情况下，聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA对癌细胞有光毒性，能够有效的杀伤癌细胞Hela，可以作为光敏剂用于PDT，而聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA对正常细胞几乎没有光毒性，是一种理想的光敏剂.

图7是HeLa细胞在不同分子量的聚合物水溶液中的存活率，从图中可以看出，高分子量的聚合物对HeLa细胞的光毒性比分子量低的聚合物低得多.出现这一现象的原因是聚合物一般没有任何细胞毒性，而产物的光毒性主要来自于卟啉分子，在分子量较高的Por-PNIPAM-b-POEGMA中，卟啉分子的含量较低，因而光毒性也相对较弱.

Concentration(mg/mL)图7 Por-PNIPAM43-b-POEGMA10和Por-PNIPAM43-b-POEGMA7共聚物对HeLa细胞存活率曲线

3 结 论

实验所得结论如下：Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA在没有光照的条件下，对正常细胞L929和癌细胞HeLa都具有较低的毒性，说明它们具有较好的生物相容性.在光照条件下，Por-PNIPAM-b-POEGMA比Por、Por-PNIPAM的细胞毒性强，Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA分别对L929的毒性弱于对Hela的毒性.分子量高的Por-PNIPAM-b-POEGMA的光毒性更低.