柚皮苷调控miR-199a-5p/ECE1 分子轴促进骨损伤修复

刘 冲，曹 慧，杨彩彩，王 震

（榆林市第一医院骨科二病区，陕西榆林 719000）

骨缺损可能是意外、感染和许多其他情况引起的疾病，小骨缺损会自行愈合，而大骨缺损会因为自体的修复机制难以修复超过骨再生临界值而无法自行修复[1]。骨移植是临界尺寸骨缺损的主要治疗方法，自体骨移植是骨移植的黄金标准，但由于无法获得足够数量的自体移植物，在需要进行大量填充和移植的患者中并不合适；异种移植虽然可以克服这些缺点，但这些替代物的骨诱导和骨传导能力低[2]，因此，研究骨诱导和传导能力有利于骨缺损后的修复治疗。

柚皮苷（Naringin，NAR） 是骨碎补的主要有效成分，属于多甲氧基黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎及促进骨形成等作用[3]。有研究表明，柚皮苷可通过调控miRNAs 表达水平发挥其作用，例如，柚皮苷可通过上调miR-20a 的表达水平促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化[4]。据报道，miRNAs 在多种疾病中异常表达，调控细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期等生物过程[5]，例如，miR-199a-5p 可通过抑制内质网应激减轻神经细胞凋亡和炎症[6]；miR-199a-5p 可通过靶向Mafb 蛋白正向调控RANKL 诱导破骨细胞分化[7]，但其在骨损伤修复中研究较少。内皮素转换酶-1（ECE1）作为miR-199a-5p 的靶基因是一种强有力的血管收缩剂，其表达与更大、更强壮、更致密的骨骼的存在有关[8]。因此，本研究旨在探讨柚皮苷通过调控miR-199a-5p/ECE1 分子轴对骨损伤修复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MC3T3-E1 细胞（货号：CBP60946） 购买于南京佰科生物科技有限公司，柚皮苷购买于上海吉至生化科技有限公司，CO2培养箱购买于上海冠森生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养将冻存的MC3T3-E1 细胞从液氮罐中取出，置于37℃水浴锅中，不停摇晃至完全溶解，转移至5 mL 含10%胎牛血清DMEM 培养液中，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入新鲜的含胎牛血清及青霉素和链霉素的DMEM 培养液重悬，轻轻吹打混匀后置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。48 h 后，向各孔加入不同浓度柚皮苷（5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL），继续培养48 h 后检测不同浓度柚皮苷对细胞增殖的影响。

1.2.2 细胞转染取处于对数生长期的MC3T3-E1细胞，用胰蛋白酶消化后，将细胞以1×105个/孔的密度接种于6 孔板，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书将 si-ECE1、miR-199a-5p mimics/inhibitor 转染于MC3T3-E1 细胞中，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h 待用。

1.2.3 Western blotting 检测MC3T3-E1 细胞中蛋白表达水平MC3T3-E1 细胞经相应的处理后，用预冷PBS 轻轻洗涤3 次，冰上用Western 蛋白裂解液裂解15 min，12 000 r/mim 离心20 min 收集上清；用BCA 法测蛋白含量，每组用等量蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳分离，200 mA 恒定电流电转90 min 将蛋白转印至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭孵育2 h 后加入一抗（1:1 500），4℃孵育过夜，然后用过氧化物酶结合的二抗（1:1 000）。使用化学发光试剂曝光显影，于凝胶成像仪上观察拍照，采用Image J 灰度分析软件分析灰度值，计算蛋白相对表达水平。

1.2.4 MTT 检测MC3T3-E1 细胞增殖活力收集处于对数生长期的待测细胞，以1×105个/ 孔的密度接种于48 孔板，每孔0.5 mL，将细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。分别在培养一定时间时加入50 μL MTT 溶液，继续培养4 h 后，1 000 r/min 离心10 min，小心吸去上清，每孔加入300 μL二甲基亚砜，吹打均匀后，每孔取200 μL液体移入新的96 孔板，用酶联免疫检测仪测定在490 nm 处的吸光值。

1.2.5 RT-qPCR 检测miRNAs 表达使用Trizol试剂盒提取细胞中的总RNA，在提取过程中注意避免RNA 降解和污染。采用一步法逆转录试剂盒将全部RNA 逆转录成cDNA，以U6 为内参，进行PCR 扩增，扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共50个循环。引物序列见表1，结果采用2-△△Ct表示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测miR-199a-5p 和ECE1 靶向关系StarBase 数据库预测miR-199a-5p 和ECE1 的结合位点。采用基因突变技术改变miR-199a-5p 和ECE1 的结合位点或扩增ECE1 3’-UTR 片段，分别插入荧光素酶报告基因PmirGLO 中，产生ECE1 基因突变型MUT-PmirGLO-ECE1-3’ -UTR 和 野 生 型WT-PmirGLO-ECE1-3’ -UTR。将 miR-199a-5p mimics 或阴性对照分别与WT-PmirGLO-ECE1-3’-UTR 和MUT-PmirGLO-ECE1-3’-UTR 共转染到MC3T3-E1 细胞中，培养48 h，用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组荧光素酶活性。

1.2.7 MC3T3-E1 细胞ALP 活性检测取各组待测细胞，用胰蛋白酶消化后，将细胞以1×105个/孔的密度接种于24 孔板，每孔0.5 mL。培养14 d用PBS 洗涤3 次，加入RIPA 蛋白裂解液，反复冻融裂解细胞，然后加入ALP 检测试剂孵育30 min后再加入3 M NaOH 终止反应，酶标仪检测490 nm吸光度值（OD 值）。

1.2.8 茜素红染色检测MC3T3-E1 细胞矿化情况取各组待测细胞，胰蛋白酶常规消化后将细胞以1×105个/孔的密度接种于24 孔板，培养14 d 用PBS 洗涤3 次，4%戊二醛溶液固定30 min，2%茜素红染色30 min，PBS 洗涤3 次后光镜观察并拍照。

1.3 统计学处理

采用SPSS 进行统计学分析，所有试验均重复三次，数据以表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。统计图采用GraphPad 7.0 软件进行绘制。

2 结果

2.1 柚皮苷促进骨损伤修复

MTT 检测结果显示，用不同浓度柚皮苷（5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL） 处 理MC3T3-E1 细胞后，显著促进细胞增殖活力（P＜0.001），且在20 ng/mL 时细胞增殖活力最强（图1A，P＜0.01）。Western blotting 检测结果显示，柚皮苷（20 ng/mL）能显著促进Runx2、OPN、BMPs、OC 表达（图1B，P＜0.01，P＜0.001）。MC3T3-E1 细胞ALP 活性检测结果显示，柚皮苷能显著促进MC3T3-E1 细胞ALP 活性（图1C，P＜0.01）。茜红素染色检测结果显示，柚皮苷能显著促进MC3T3-E1 细胞的钙矿化（图1D，P＜0.01）。由此可知，柚皮苷能促进MC3T3-E1 细胞增殖和成骨分化和钙矿化，以此促进骨损伤修复。

图1 柚皮苷对骨损伤修复的影响Fig.1 Effects of naringin on bone injury repair

2.2 柚皮苷上调MC3T3-E1 细胞中miR-199a-5p 表达

RT-qPCR 检测结果显示，柚皮苷能显著上调与骨损伤修复相关miRNAs 的表达水平，尤其是miR-199a-5p 的表达水平（图2，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。由此可知，柚皮苷能上调MC3T3-E1 细胞中miR-199a-5p 表达水平。

图2 柚皮苷对MC3T3-E1 细胞中与骨损伤修复相关miRNAs 的表达的影响Fig.2 Effects of naringin on the expression of miRNAs related to bone injury repair in MC3T3-E1cells

2.3 miR-199a-5p 靶向下调ECE1 表达

通过生物学信息库 StarBase 2.0 预测miR-199a-5p 的靶基因，结果显示，发现ECE1 是miR-199a-5p 的候选靶基因（图3A）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，过表达miR-199a-5p 能使ECE1 野生型载体的荧光素酶活性显著降低，而对ECE1 突变型载体的荧光素酶活性无显著影响（图3B，P＜0.01）。Western blotting 检测结果显示，转染miR-199a-5p mimic 后ECE1 的表达显著降低；柚皮苷也可显著降低MC3T3-E1 细胞中ECE1的表达（图3C，P＜ 0.01）。由此可知，miR-199a-5p 可靶向下调ECE1 的表达。

2.4 柚皮苷通过调控miR-199a-5p/ECE1 分子轴促进骨损伤修复

Western blotting 检测结果显示，敲降ECE1后，MC3T3-E1 细胞中ECE1 表达显著下调，而同时敲降ECE1 和miR-199a-5p 后回复单独敲降ECE1 对ECE1 表达的抑制作用（图4A，P＜0.001）。MTT、ALP 活性检测、茜素红染色检测结果显示，柚皮苷显著促进MC3T3-E1 细胞增殖活力、ALP 活性和钙矿化能力；敲降miR-199a-5p后回复柚皮苷对MC3T3-E1 细胞增殖活力、ALP活性和钙矿化的促进作用，且与NC 组无显著差异；敲降ECE1 后显著促进了柚皮苷对MC3T3-E1细胞增殖活力、ALP 活性和生物矿化能力的促进作用；同时敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷对MC3T3-E1 细胞增殖活力、ALP 活性和钙矿化能力的促进作用比单独敲降miR-199a-5p 显著增加，比单独敲降ECE1 显著降低（图4B）。Western blotting 检 测MC3T3-E1 细 胞 中Runx2、OPN、BMPs、OC 表达水平，检测结果显示，柚皮苷显著促进Runx2、OPN、BMPs、OC 表达水平；敲降miR-199a-5p 后回复柚皮苷对Runx2、OPN、BMPs、OC 表达的促进作用；敲降ECE1 后显著上调了柚皮苷对Runx2、OPN、BMPs、OC 表达的促进作用；同时敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷对Runx2、OPN、BMPs、OC 表达的促进作用比单独敲降miR-199a-5p 显著增加，比单独敲降ECE1 显著降低（图4C，P＜0.01，P＜0.001）。ALP 活性检测、茜素红染色检测结果显示，柚皮苷显著促进ALP 活性和钙矿化能力；敲降miR-199a-5p 后回复柚皮苷对ALP 活性和钙矿化的促进作用，且与NC 组无显著差异；敲降ECE1后显著促进了柚皮苷对ALP 活性和生物矿化能力的促进作用；同时敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷对ALP 活性和钙矿化能力的促进作用比单独敲降miR-199a-5p 显著增加，比单独敲降ECE1显著降低（图4D、4E，P＜0.01）。由此可知，柚皮苷通过调控miR-199a-5p/ECE1 分子轴促进骨损伤修复。

图3 miR-199a-5p 对ECE1 表达的影响Fig.3 Effects of miR-199a-5p on ECE1 expression

3 讨论

随着人类生产、生活节奏的加快以及人口老龄化的加剧，骨和软骨损伤的患者呈现逐年上升的趋势[9]。研究表明，骨损伤后的修复是一个特殊的过程，产生新骨的一系列有序过程受到系统和局部因子的调控，任何影响该过程的因素出现异常都会影响愈合的进程[10]，因此，明确这些事件过程和调节因素对促进骨愈合有重要意义。

图4 柚皮苷通过调控miR-199a-5p/ECE1 分子轴促进骨损伤修复Fig.4 Naringin promotes the repair of bone injury by regulating the axis of miR-199a-5p/ECE1

有研究发现，NAR 具有雌激素活性，可以降低血液胆固醇，减少血栓形成，改善局部微循环和营养供应，因此，NAR 被广泛应用于临床，预防心脑血管疾病，并作为骨折愈合的辅助治疗手段[11]。另有研究发现，NAR 可通过上调骨形态发生蛋白（BMPs） 的表达促进成骨细胞的增殖和分化，使骨密度增加，促进骨形成[12]。此外，NAR 还可将地塞米松导致的MC3T3-E1 细胞骨桥蛋白和骨保护素蛋白表达减少及碱性磷酸酶的活性减退逆转改善，并增加他们的骨矿物质密度，表现出较好的成骨作用[13]。本研究发现，柚皮苷可促进MC3T3-E1 细胞增殖，促进MC3T3-E1 细胞中促进成骨分化相关基因（Runx2、OPN、Collagen-Ⅰ、OC、BMP） 的表达，增加成骨细胞ALP 活性并促成骨细胞进生物矿化，从而促进骨损伤修复。

众所周知，miRNA 在多种疾病中异常表达，可通过与靶mRNA 结合调节蛋白表达，进而影响细胞生物学过程。据报道，有许多中药的活性提取物都可通过介导细胞中miRNAs 表达调控细胞生物学过程。例如，淫羊藿活性提取物淫羊藿苷可通过抑制股骨头微血管内皮细胞中miR-335 的表达来预防激素性股骨头坏死的发生[14]；骨碎补提取物柚皮苷可通过增加miR-126 的表达下调VCAM-1 抑制人软骨肉瘤的迁移和侵袭能力[15]。有研究表明，miR-199a-5p 在多种疾病中均起着重要的调控作用，例如，miR-199a-5p 通过靶向下调MAP3K11表达抑制非小细胞肺癌的恶性生物学进程[16]；过表达miR-199a-5p 抑制细胞存活和血管生成，而抑制miR-199a-5p 在肺微血管内皮细胞中的表达可促进细胞增殖和血管生成[17]；miR-199a-5p 可通过抑制HIF1α-Twist 途径促进成骨[18]。本研究发现，柚皮苷可上调MC3T3-E1 细胞中miR-199a-5p 表达，促进骨损伤修复。

内皮素（endothelin，ET） 是高度有效的血管收缩肽，参与多种人体生理、病理过程，通常以极低的浓度存在于机体中，当刺激作用于内皮细胞时，ET 会裂解成无活性的多肽，再在ECE1 的剪切作用下转化成活性多肽，以此发挥其作用[19]。ECE1 是一种Ⅱ型膜边界金属蛋白酶，在细胞表面以二聚体的形式存在，ECE1 的大胞外结构域对其催化活性起着重要作用。先前的研究表明，增强的ECE1 活性增加了ET 的合成，促进了血管平滑肌细胞的增殖和有丝分裂，活性氧的产生和炎症分子的形成，导致血压升高和动脉粥样硬化[20]。此外，ECE1 还参与了一系列疾病的发病机制，包括骨髓缺血/再灌注诱导的损伤、癌症、脑出血和骨质疏松、骨折[21-24]等，但其在骨损伤修复中的研究较少。本研究发现，miR-199a-5p 靶向下调ECE1 表达，促进骨损伤修复。

综上所述,柚皮苷通过调控miR-199a-5p/ECE1分子轴促进MC3T3-E1 细胞增殖、成骨分化和矿化，从而可促进骨损伤修复。

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