5岁以下儿童4种病毒性腹泻流行特征

刘 晨 冯 雪 邵冬华 何美琳 梁国威

婴幼儿急性腹泻病是我国儿童的常见病之一[1]。而轮状病毒(rotavirus, RV)、诺如病毒(norovirus, NORV)、肠道腺病毒(enteric adenoviruses, EADV)和人星状病毒(human astrovirus, HASTV)等是引起婴幼儿急性腹泻的主要病原体[2～5]。病毒性腹泻感染力强、传播较快、潜伏期短，极易造成疾病的流行。社会经济水平的提高、水质和卫生条件的改善并不能降低其发生率，需要医务人员尽早对疾病做出诊断[6]。而相关腹泻病毒的流行特征对于临床防治婴幼儿急性腹泻具有重要的指导意义。

基于上述研究背景和目前的研究现状，笔者对北京市航天中心医院及周边社区5岁以下儿童粪便中4种主要的腹泻病毒RV、NORV、EADV和HASTV感染和混合病毒感染进行为期1年全面的调查统计，使用荧光免疫法对上述4种腹泻病毒进行检测，分析其流行病学情况；同时用PCR法检测EADV进行方法学比对试验，为制定5岁以下儿童病毒性腹泻的预防控制策略提供科学依据。

对象与方法

1.研究对象:选取航天中心医院和永定路社区卫生服务中心2017年1～12月连续1年在门诊因急性腹泻就诊的5岁以下儿童。急性腹泻定义标准：①大便性状较平时改变，呈水样或蛋花样，无黏液和脓血，次数较平时增多，或24h内稀便≥3次，伴或不伴呕吐和发热；②病程不超过14天。门诊患儿入选需符合以下标准：①因为急性腹泻就诊；②大便镜检：WBC<5/HPF，并且无巨噬细胞。收集上述研究对象粪便标本、人口学资料及流行病学资料。本研究中受试者监护人签署知情同意书，本研究得到航天中心医院医学伦理学委员会批准同意(批件文号：20150311-YNKS-05)。

2.标本采集及处理：取患儿新鲜粪便样本约3～5g或水样便3～5ml，分为两份。一份置于PBS混悬液中混匀3000r/min离心10min，上清液作为标本直接用荧光免疫法进行检测；另一份于-80℃冷冻保存，用于DNA的提取。DNA提取方法是将0.1g或0.1ml粪便样本置于1ml 0.9%NaCl注射液中，混匀制成10%的粪便悬液，8000r/min离心5min，吸取上清液提取粪便中的DNA。采用病毒核酸提取试剂盒(中国台湾地区Geneaid公司)提取DNA，操作步骤严格按照说明书进行。

3.检测方法:腹泻病毒4项(RV、NORV、EADV和HASTV)抗原检测采用荧光免疫法，由北京博晖创新光电技术股份有限公司提供的联合检测试剂盒(试剂批号:20170101)及其配套检测仪器(BH400-Ⅱ荧光免疫层析分析仪)。针对EADV病毒hexon基因片段，采用的特异性上游引物为5′-TTCCCCATGGCICAYAACAC-3′；下游引物为5′-CCCTGGTAKCCRATRTTGTA-3′[7]。扩增片段长度482bp，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，根据有无扩增产物条带进行鉴定，详见图1。

图1 EADV病毒hexon基因PCR扩增产物电泳图M.DL2000 DNA Marker；1，2.EADV病毒hexon基因PCR产物

4.统计学方法：使用SPSS 14.0统计学软件对数据进行统计分析，组间率的比较采用χ2检验；EADV抗原荧光免疫法与PCR法检出率比较采用配对χ2检验，并以Kappa值作为两种检测方法一致性好坏的评价标准(Kappa≥0.75 一致性佳，0.40

结 果

1.4种病毒抗原荧光免疫法检出情况:1398例腹泻患儿粪便标本中共检出阳性699例(50.00%)，其中661例(47.28%)为单病毒感染，38例(2.72%)为混合病毒感染，详见图2。在单病毒感染中，RV、NORV、EADV和HASTV的阳性病例依次为422例(30.19%)、138例(9.87%)、60例(4.29%)和41例(2.93%)；在混合病毒感染中，最为常见的是RV和NORV同时感染为24例，其次是RV和EADV同时感染11例，而RV、NORV和EADV 3种病毒同时感染检测出3例。

图2 4种病毒抗原荧光免疫法检出情况

在1398例标本中，单病毒感染和混合感染合计的RV、NORV、EADV和HASTV的阳性分别为460例(32.90%)、165例(11.80%)、74例(5.29%)和41例(2.93%)，4种病毒的阳性构成比依次为62.16%、22.30%、10.00%和5.54%。

2.每月总例数及总阳性率检出情况：检测总例数及总阳性率检出情况按照自然月分布显示详见图3，1月送检总例数最多为148例，12月份病毒性腹泻患病例数最多为120例，12月份检出阳性率最高为84.50%。8月份送检总例数和病毒性腹泻患病例数均为最少，分别为84例和23例，阳性率也最低为27.38%，差异有统计学意义(P<0.01)。总之，秋、冬季节送检总例数、病毒性腹泻患病例数及阳性率均高于春、夏季节。

图3 每月总例数及总阳性率检出情况

3.不同性别、年龄患儿4种病毒抗原检出情况：1398例腹泻患儿粪便标本中，男性729例，女性669例，其中，4种单病毒感染和混合病毒感染的男性、女性患儿例数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。月龄分组显示，RV、NORV、HASTV和混合病毒感染在7～12、13～24和25～36月龄组患儿中阳性率均比其他月龄组高，EADV在7～12月龄组的阳性率比其他月龄组高，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表1。

4.不同时间患儿4种病毒抗原检出情况:4种单病毒感染和混合病毒感染情况按照自然月分布进行分析显示(图4)，RV在1～2月份和10～12月份，也就是秋、冬季节阳性率最高，与3～9月份比较，差异有统计学意义(P<0.01)；NORV阳性率在4～5月份和12月份出现双峰升高，与1～3月份和6～11月份比较，差异有统计学意义(P<0.01)；EADV在5～8月份，也就是夏季阳性率最高，与1～4月份和9～12月份比较，差异有统计学意义(P<0.01)；HASTV阳性率在9～11月份明显升高，与1～8月份和12月份比较，差异有统计学意义(P<0.01)；而对于混合病毒感染，各季节感染率比较，差异无统计学意义。

表1 不同性别、年龄患儿腹泻病毒阳性检出情况[n(%)]

图4 不同时间患儿4种病毒抗原检出情况

5.EADV抗原荧光免疫法与PCR法检出率比较：采用配对资料的χ2检验对荧光免疫法和PCR法的检测结果进行对比分析，荧光免疫法抗原检出74例，PCR法检出88例。PCR法检出率占总检出率的88.89%(88/99)，荧光免疫法检出率占总检出率的74.75%(74/99)，两种方法检出共同阳性63例，一致阳性率为63.60%(63/99)。配对χ2检验显示，PCR法检出率高于荧光免疫法抗原检出率，阳性检出率差异有统计学意义(χ2=823.397，P=0.029)，但Kappa=0.764，显示两种方法仍具有一致性，详见表2。

表2 荧光免疫法与PCR法对肠道腺病毒的检出情况(n)

讨 论

病毒性腹泻属于《中华人民共和国传染病防治法》中规定的丙类传染病，对各年龄人群特别是5岁以下儿童的身体健康有极大威胁，这其中主要包括了RV、NORV、EADV和HASTV等多种腹泻病毒。本研究对航天中心医院及周边社区5岁以下儿童门诊病例中常见的4种腹泻病毒及混合病毒感染情况进行了调查统计，检出腹泻病毒的标本阳性率为50.00%，这与近年来报道的儿童腹泻病毒阳性率为24.05%～58.42%相符，而且检测方法不同、研究地区不同也会造成结果的差别[8～10]。其中RV(30.19%)是导致腹泻最主要的病毒，NORV(9.87%)、EADV(4.29%)和HASTV(2.93%)感染阳性率相对较低，此外还有38例为混合病毒感染。

RV在世界范围内是引起婴幼儿急性和重症腹泻最常见的病原体。最近监测显示我国因腹泻入院检查的5岁以下儿童中RV阳性率高达68.60%，也是目前相关研究最深入的腹泻病毒和唯一有疫苗能够预防的腹泻病毒[11]。NORV属单股正链RNA病毒，是第一个被证实可引起人类急性胃肠炎的病毒，极易发生抗原变异，被称为“胃肠道流感病毒”。已有研究证实NORV与12%的轻、中度腹泻患者有关，是婴幼儿腹泻仅次于RV的病毒性致病原[12]。EADV是一种双链DNA病毒，感染呈全球性分布，在婴幼儿急性腹泻中EADV的检出率为1.1%～12.0%，但值得注意的是，在无症状儿童的粪便标本中也可以检测出EADV，也就是说EADV可能会引起隐性感染[7,13]。HASTV属于单股正链RNA病毒，世界各地均有报道感染，己经确认可感染各个年龄段人群，但主要感染儿童、老年人和免疫缺陷人群。世界各地的感染发生率报道有所差别，其中北京儿童医院调查得出的结论是9.0%[14]。

秋、冬季节送检总例数、病毒性腹泻患病例数及阳性率均高于春、夏季节。4种单病毒感染及混合病毒感染均无性别差异，但是在7～36月龄为病毒性腹泻的高发月龄。这可能与儿童的生理免疫状态特点有关，6个月及以下婴幼儿从母体乳汁中获得了大量的抗体，尤其是sIgA抗体，有很强的免疫保护作用；而6个月以上儿童由于母乳喂养的结束、母乳中抗体量显著减少且自身的免疫系统尚未发育成熟、消化系统功能薄弱，因此容易感染各种病原体[15]。3岁以上儿童随着自身免疫功能的逐渐完善，血清及小肠分泌特异性免疫球蛋白的增加，抗感染能力增强。由于样本量有限、调查年限较短，统计结果可能有一定的误差，但对总体趋势无明显影响。在时间分布特征上，4种单病毒感染及混合病毒感染也表现出了明显的差别，RV秋、冬季节比春季高发，NORV春季和秋、冬季节高发，EADV在夏季高发，HASTV的阳性率在秋季明显升高。而对于混合病毒感染的样本，由于例数较少，其差异无统计学意义。

除此以外，笔者还对荧光免疫法和PCR法的检测结果进行比较分析，PCR法检出率高于荧光免疫法抗原检出率，两种方法的阳性检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。采用Kappa值作为两种检测方法一致性好坏的评价标准，为0.764≥0.750一致性佳。其中PCR法对EADV的阳性检出率更高。造成阳性检出率差异的原因可能为：(1)腺病毒是双链DNA病毒，含52种血清型，根据其生物学特点将其分为A～F 6个亚类[4]。其中EADV 就是指F亚类中的F40、F41，是引起儿童急性胃肠炎的主要血清型。而PCR法中针对腺病毒hexon基因片段的引物是针对所有亚型腺病毒的，包括但不仅限于EADV，在以后的研究中，笔者还会对腺病毒的基因分型进行进一步分析。(2)在无症状儿童的粪便标本中也可以检测到EADV，表明EADV有引起隐性感染的可能性。(3)荧光免疫法敏感度较高，也就是说假阳性率可能会偏高[16]。经过方法学的比较，不难看出快速的筛查方法对辅助诊断病毒性腹泻很重要。目前腹泻病毒的检测多采用PCR检测，操作步骤多、耗时长，多重病毒联合PCR检测由于假阳性率较高应用并不广泛，且筛查相对费时、费力[17]。而荧光免疫法实验过程相对简单、耗时短，且一次实验能同时检测4种病毒，更好地适应了临床需求，但假阳性率高，更适合初筛，进一步确认还是需要做PCR检测[16]。而两种检测方法联合检测，能大大提高肠道腺病毒的阳性检出率，减少漏诊率。

综上所述，通过本项研究笔者对航天中心医院及周边社区5岁以下儿童的病毒性腹泻病原谱有了基本了解，4种腹泻病毒在阳性检出率、年龄分布、时间分布上均有一定的特征，这为病毒性腹泻的预防控制、疾病监测方面提供了基础数据，但本研究对各病毒基因型的构成情况未深入研究。为提高检出率、减少漏诊率、满足临床日益增长的检测需求，检测相关腹泻病毒时，建议采用抗原阳性检出率较高、检测工效较高的实验方法比如荧光免疫法作为初步筛查，同时在必要情况下结合PCR法以防止漏检，为临床治疗提供及时、有效的实验信息。