血清p62及LC3-Ⅱ联合检测对HBV-ACLF患者近期预后的价值

刘铁峰 许澍妮 吴姗姗

慢加急性肝功能衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是慢性肝病患者由于急性肝功能失代偿而出现的临床症候群，表现为黄疸、凝血障碍，并通常于4周内出现腹水等症[1]。在国内，乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭(hepatitis B related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)最为普遍[2]。HBV-ACLF病死率高，对其预后进行准确判断，并于适当时机行人工肝或肝移植治疗，对降低病死率和合理利用医疗资源具有重要意义[3]。近期研究表明自噬在ACLF等肝脏疾病的发生、发展中发挥重要作用[4,5]。p62和微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)为自噬相关蛋白，能反映机体自噬水平[6]，其对于判断HBV-ACLF患者预后价值尚待明确。本研究对HBV-ACLF患者血清自噬相关蛋白(p62，LC3-Ⅱ)水平进行测定，并探讨二者联合检测在判断HBV-ACLF患者近期预后中的价值，现报告如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年9月至2018年9月在辽宁中医药大学附属医院就诊的78例HBV-ACLF患者，女性22例，男性56例，年龄21～68岁，平均(47.5±8.6)岁。纳入标准：①符合《肝衰竭诊治指南(2012年版)》[7]中ACLF诊断标准；②有乙型肝炎病史，HBsAg阳性持续6个月以上；③研究经院伦理委员会通过且患者知情同意。排除标准：①合并其他病毒感染者；②药物性肝损伤或自身免疫性肝病者；③酒精性肝病或代谢性肝病者；④合并肾脏疾病及肾功能不全者。另选取同期健康体检者42名作为对照组，其中女性13名，男性29名，年龄23～64岁，平均(46.5±8.3)岁，两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

二、方法

入院后抽取患者清晨空腹静脉血，总胆红素(TBil)和肌酐(Cr)使用全自动生化分析仪(雅培CI8200)测定，国际标准化比值(INR)使用自动凝血仪(Sysmex CA-500)检测；计算终末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)分值。血清p62和LC3-Ⅱ水平检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，LC3-Ⅱ检测试剂盒购自江莱生物科技有限公司，p62检测试剂盒购自上海雨朵生物科有限公司，操作严格按照说明书进行。

记录患者基线MELD分值及患者入院后3个月内临床结局，比较ACLF组和对照组入院时血清p62和LC3-Ⅱ水平。

三、统计学方法

结 果

一、ACLF组与健康对照组血清p62和LC3-Ⅱ水平比较

ACLF组血清LC3-Ⅱ水平明显高于对照组，p62水平低于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 ACLF组与正常对照组血清p62和LC3-Ⅱ水平比较(±s)

二、血清p62和LC3-Ⅱ水平与MELD评分的相关性

ACLF组入院后MELD评分为(23.04±5.84)分，采用Pearson相关分析HBV-ACLF患者血清p62和LC3-Ⅱ水平与MELD评分相关性，结果显示血清p62与MELD评分呈负相关(r=0.383，P<0.05)；血清LC3-Ⅱ与MELD评分呈正相关(r=0.458，P<0.05)。

三、血清p62和LC3-Ⅱ对HBV-ACLF患者近期预后的评估价值

观察期间，78例HBV-ACLF患者中，38例死亡，占48.7%。生存组与死亡组HBV-ACLF患者血清p62，LC3-Ⅱ表达水平比较，结果死亡组血清LC3-Ⅱ表达水平显著高于生存组，血清p62水平低于生存组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 生存组与死亡组HBV-ACLF患者血清p62， LC3-Ⅱ表达水平比较(ng/mL，±s)

通过ROC曲线确定p62，LC3-Ⅱ预测的最佳临界值，取约登指数最大时对应的p62，LC3-Ⅱ水平作为临界值，分别为1.51 ng/mL、80.74 ng/mL。血清p62、LC3-Ⅱ和二者联合预测的AUC分别为0.727(95%CI：0.616～0.821)、0.736(95%CI：0.626～0.828)和0.813(95%CI：0.710～0.892)，二者联合预测的AUC大于p62(Z=2.005，P=0.045)，LC3-Ⅱ(Z=2.005，P=0.046)单项，差异有统计学意义(均P<0.05)，而p62与LC3-Ⅱ预测HBV-ACLF预后的AUC比较差异无统计学意义(Z=0.121，P=0.904)。见表3。

表3 血清p62、LC3-Ⅱ和二者联合预测HBV-ACLF 患者近期预后的效力比较

讨 论

HBV-ACLF是我国肝衰竭中最常见的亚型，患者可出现多器官功能衰竭和全身性炎症反应综合征，临床病死率高达50%[8]。研究发现，异常的信号通路调节及自噬在肝脏疾病发生、发展中发挥重要作用[9]。证据显示，自噬在慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的发生、发展中起重要作用，并可能影响疾病的进展和转归[10]。生理水平的自噬在清除受损蛋白、细胞器，维持内环境稳定方面具有重要意义，而过高或过低的自噬水平则与疾病相关[11]。在慢性肝炎、肝硬化和肝衰竭中可出现自噬水平升高，而当疾病进展至肝癌时则表现为自噬水平降低[12]。LC3是与自噬相关的蛋白，包括两种亚型，分别为LC3-I和LC3-Ⅱ。当自噬发生时，LC3-I脂质化后形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ再与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺结合并定位在胞内自噬体膜上[13]。因此，LC3-Ⅱ含量与自噬体数量呈正比，其可作为反映自噬起始阶段的一种有效分子标记物。自噬体是整个自噬动态过程中的一个中间结构，因此仅使用自噬体数量或LC3-Ⅱ含量来体现自噬活性的强弱不够全面。自噬体形成后尚需与溶酶体融合才能执行自噬降解功能。当出现自噬体与溶酶体融合过程受阻时，自噬体降解减少，亦可导致自噬体数量增加。自噬降解底物p62蛋白是与LC3-Ⅱ和泛素化蛋白聚集体相关的衔接蛋白，其C端与泛素化蛋白绑定，通过N端与LC3-Ⅱ作用，并在自噬过程中整合入自噬吞噬体中，继而在自噬溶酶体中降解，其表达量越高，则表明自噬功能越弱[14]。本研究结果显示， HBV-ACLF患者LC3-Ⅱ蛋白的表达水平显著高于健康人，p62蛋白表达水平低于健康人，提示HBV-ACLF患者的肝功能减弱和肝脏组织变化引起自噬水平被激活。

MELD评分是在终末期肝病预后评估中应用最多的一种模型[15,16]。刘磊等[17]使用MELD评分对HBV-ACLF患者短期预后进行评估，发现其具有较好的预后评估价值。本研究通过相关性分析发现血清p62与MELD评分呈负相关，血清LC3-Ⅱ与MELD评分呈正相关，表明血清p62、LC3-Ⅱ水平与HBV-ACLF患者疾病预后有密切关联。此外通过ROC曲线分析发现，血清p62、LC3-Ⅱ水平对HBV-ACLF患者近期预后具有较好的评估价值，且将二者联合用于预测时，其预测能力明显提升。

本研究检测了78例HBV-ACLF患者入院时血清p62，LC3-Ⅱ水平，并分析了二者与HBV-ACLF患者近期预后的关系，结果显示二者对HBV-ACLF患者近期预后有较好的评估价值，二者联合应用时预测效力明显提升，