响应面法优化花生壳中木犀草素提取工艺研究

陈方园，蒋立勤，刘腾飞，余 静，孙玉冰，林 瑶

(浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053)

花生(Arachishypogaea.L)为豆科(Leguminosae)落花生属植物，是我国种植非常广泛的农作物，其副产品花生壳占比较大，但资源利用率较低，仅有少量被加工成饲料或用于化工原料的制备[1-2]。花生壳含有大量黄酮类化合物[3-4]，其中以木犀草素为主，具有抗氧化、抗菌消炎、镇咳、祛痰平喘、增强免疫和抗肿瘤等作用[5-12]。花生壳是目前已知含木犀草素较高的可再生、来源丰富的植物资源，是制备木犀草素的理想原料。近年来，国内外对花生果实进行了一系列研究[13-15]，而对其茎壳的研究报道相对较少。因此，本课题利用高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)检测花生壳中木犀草素含量，响应面法优化提取工艺，为花生壳木犀草素的开发利用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料

花生果：浙江省临安市提供，手工剥壳，烘干，粉碎过60目筛得到花生壳粉末；木犀草素标准品(98%)：购自上海金穗生物公司，批号：491-70-3。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 FW-135粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；FA2004电子天平，上海市菁海仪器有限公司；GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；B-206电热恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；KQ-250DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A台式离心机，上海安亭科学仪器厂；Waterse2695高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.2.2 试剂 无水甲醇(分析纯)、磷酸(分析纯)、甲醇(色谱纯)等。

1.3 木犀草素含量测定[16]

1.3.1 色谱条件 hypersilods2色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。

1.3.2 标准品溶液的制备 精密称取木犀草素标准品5.00 mg，用适量甲醇溶解，转移至50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容后摇匀，制成浓度为0.1 mg/mL的木犀草素标准品溶液。

1.3.3 线性关系考察 精密称取10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL的0.02 mg/mL木犀草素对照品进样，按上述色谱条件测定，在HPLC上测定并记录木犀草素的出峰时间及其峰面积，以进样体积为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，建立回归方程。

1.3.4 精密度试验 木犀草素标准品溶液0.02 mg/mL，重复进样5次，进样体积为20 μL，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)。

1.3.5 稳定性试验 木犀草素标准品溶液0.02 mg/mL，分别在制备0、1、2、6、8 h进样，进样体积为20 μL，计算峰面积的RSD。

1.3.6 加样回收试验 精密称取已知木犀草素含量的花生壳样品1 mg，共9份，3份一组，分别加入0.015、0.030、0.060 mg木犀草素标准品，按样品提取方法进行提取并测定含量，计算木犀草素平均加样回收率。

1.4 单因素试验[17]

1.4.1 甲醇体积分数对提取率的影响 取1 g花生壳粉末，共6份，分别加入60%、65%、70%、75%、80%、90%的甲醇溶液20 mL，置于80 ℃恒温水浴锅中提取0.5 h。静置，待其冷却，以3 500 r/min的转速离心20 min，取上层清液2 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度线后摇匀，按标线测定的方法进样，平行测试三组。测得木犀草素含量与甲醇体积分数的关系。

1.4.2 料液比对提取率的影响 取1 g花生壳粉末，共6份，分别以料液比(g/mL)为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40加入80%的甲醇溶液，置于80 ℃的恒温水浴锅中提取0.5 h。静置，待其冷却，以3 500 r/min的转速离心20 min，取上层清液2 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度线后摇匀，按标线测定的方法进样，平行测试三组。测得木犀草素含量与料液比的关系。

1.4.3 提取时间对提取率的影响 取1 g花生壳粉末，共6份，加入80%的甲醇溶液20 mL，置于80 ℃的恒温水浴锅中分别提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h。静置，待其冷却，以3 500 r/min的转速离心20 min，取上层清液2 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度线后摇匀，按标线测定的方法进样，平行测试三组。测得木犀草素含量与提取时间的关系。

1.5 响应面法优化提取工艺

响应面法Design-Expert8.0.5优化提取[18-19]，实验采用Box-Benhnken中心组合设计，按照设计所得的方案对花生壳进行提取测定，并根据所得的数据，采用Design-Expert软件对其进行回归拟合，得出木犀草素提取率与三因素之间的回归方程。进而对方程进行回归分析及方差分析，考察实验设计模型的可行性与三因素(甲醇体积分数、料液比、提取时间)对响应值(木犀草素提取率)之间的相关性，以期得到花生壳中木犀草素的最佳提取工艺，并通过HPLC测定在最佳提取工艺下花生壳中木犀草素的含量。响应面分析因素水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平

2 结果与讨论

2.1 木犀草素含量测定结果

2.1.1 线性关系试验 以色谱峰面积(Y)对进样质量(X)进行回归，得到木犀草素标准曲线方程为Y=4E006X+14310，R2=0.999 7，线性范围在0.2～0.6 μg之间。在本试验的色谱条件下，木犀草素的保留效果较好，基本达到基线分离，出峰时间约为7.5 min，分析时间较短，有利于快速分析。木犀草素标准品的HPLC色谱见图1，花生壳供试样品的HPLC色谱见图2。

图1 木犀草素标准品的HPLC色谱

图2 花生壳供试样品的HPLC色谱

2.1.2 精密度试验 测得木犀草素的峰面积RSD为2.20%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性试验 测得木犀草素的峰面积RSD为2.80%，表明仪器进样稳定性良好。

2.1.4 加样回收试验 测得木犀草素的平均回收率为99.2%，RSD为0.48%，表明本方法具有良好的准确性。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 甲醇体积分数对提取率的影响 木犀草素的提取率依次为27.6、35.2、35.4、37.1、53.8、32.5 μg/g。甲醇体积分数为80%时木犀草素提取率达到最大，当甲醇体积分数升为90%时，木犀草素提取率反而下降，故选取80%甲醇为最佳浓度，结果见图3a。

2.2.2 料液比对提取率的影响 木犀草素的提取率依次为38.4、37.9、47.0、43.5、36.3、42.2 μg/g。料液比为1∶25时木犀草素提取率达到最大，且当料液比继续增大时，木犀草素提取率反而下降，故选取1∶25为最佳料液比，结果见图3b。

2.2.3 提取时间对提取率的影响 木犀草素的提取率依次为43.2、43.3、43.3、45.5、53.2、36.1 μg/g。提取时间较短时，木犀草素提取率较为平稳，当提取时间为2.5 h时，木犀草素提取率达到最大，且当提取时间继续增大时，木犀草素提取率反而变小，故选取2.5 h为最佳提取时间，结果见图3c。

图3 甲醇体积分数、料液比、提取时间对木犀草素提取率的影响

2.3 响应面优化结果

2.3.1 响应面数值分析 响应面分析方案与响应值结果见表2。根据表2中的实验数据，采用Design-ExpertV8.0.5软件对其进行回归拟合，得到的木犀草素提取率(Y)对甲醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)的回归方程：Y=30.63+0.093A+0.053B-0.065C-0.51AB-0.052AC-2.27BC-1.33A2-1.57B2-1.43C2。

2.3.2 回归方程各项方差分析 响应面回归方程模型的方差分析结果见表3。由表3可见，甲醇体积分数对木犀草素提取率有非常显著的影响，提取时间和液料比有显著影响，提取时间和液料比交互作用时，对木犀草素提取率具有极明显的影响。模型P值<0.000 1，响应回归模型具有极显著性，失拟项P>0.05，表明失拟不显著，说明该回归模型拟合程度较好，可用于花生壳中木犀草素的提取工艺的理论预测。

表2 响应面分析方案与响应值结果

表3 响应面回归方程模型的方差分析结果

注：***P<0.001为极显著，**P<0.01为非常显著，*P<0.05为显著。

2.3.3 响应面分析 响应面图[20]能够非常直观明确地反映出各单因素之间的交互作用以及对响应值的影响，响应曲面越陡，表明该因素条件对响应值的影响越大，反之，响应曲面越平稳，表明该因素条件对响应值的影响越小。图4为回归模型的响应面分析图，由图4可知，A(甲醇体积分数)和B(料液比)、B(料液比)和C(提取时间)存在显著的交互作用，表现为响应曲面呈现出高度扭曲；A(甲醇体积分数)和C(提取时间)的交互作用不显著，表现为曲面扭曲程度较低。采用SAS工具箱对回归方程进行一阶求偏导，得到响应值(Y)处于最大值时的A、B、C的编码值分别为：A=0.02，B=0.07，C=-0.08。即花生壳木犀草素的最佳提取工艺为甲醇体积分数81.6%，料液比1∶26.75，提取时间2.3 h。在此工艺下，木犀草素提取率理论值为30.64 μg/g。

图4 甲醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)与木犀草素提取率的响应面分析

2.3.4 验证试验 为了验证实验模型预测的准确性，在试验得出的最佳花生壳木犀草素提取条件下，进行验证试验重复3次。得到的木犀草素提取率的平均值为30.38 μg/g，RSD值为1.34%。理论预测值与试验值的相对误差为0.26 μg/g，可见该模型具有较强的预测性，优选的花生壳中木犀草素提取工艺准确可靠、合理可行。

3 结语

利用高效液相色谱法可以高效准确地测定出花生壳中木犀草素的含量，并结合响应面法优化花生壳中木犀草素的提取工艺，确定了最佳提取方案为甲醇体积分数81.6%，料液比1∶26.75，提取时间2.3 h。在此工艺下，木犀草素提取率为30.64 μg/g。经验证该方法稳定可行，为花生壳的综合利用、木犀草素的进一步开发提供了理论和实践依据。