基于网络药理学研究柴胡疏肝散治疗急性胰腺炎的作用机制*

曹伊媛，陈 颖，周 薏，张慧倩，李国文△

1.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院药剂科(上海 200082)；2.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院消化内科(上海 200082)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一种非细菌性的炎性疾病，其特征是严重的炎症和腺泡细胞的凋亡，是临床常见急腹症[1]。在中医学范畴，AP属于里实热证，肝郁气滞证为其主要证候。柴胡疏肝散(Chaihu Shugan San,CSS)为肝郁气滞证急性胰腺炎的主方，出自于《景岳全书》，具有疏肝解郁，理气通腑的作用，原方由“醋炒陈皮、柴胡各二钱，川芎、麸炒枳壳、芍药各一钱半，炙甘草五分，香附一钱半”组成[2-3]。

网络药理学是基于“疾病-基因-靶点-药物”概念的药物研究模式，站在系统、综合的角度看待药物对疾病网络的干预和影响，以揭示药物对人类的复杂机制[4]。中医的整体观以及中药复方中的多成分、多途径和多靶点协同作用与网络药理学的系统性相统一[5]。因此，本研究通过网络药理学的方法，建立CSS-AP-靶点互作网络，诠释CSS治疗AP的可能作用机制。

材料与方法

1 材 料 中药系统药理数据库(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)，PDB数据库(https://www.rcsb.org/)，PubChem数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)，DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)，TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)，Discovery studio 3.0，STRING 数据库(https://string-db.org/)，Cytoscape 3.7.2软件。

2 研究方法

2.1 CSS活性成分虚拟筛选：本研究通过TCMSP数据库检索CSS全方成分，口服生物利用度(OB)≥ 35%，类药性(DL)≥ 0.2，药物半衰期(HL) ≥8为阈值，筛选CSS中的活性成分作为候选化合物。

2.2 CSS活性成分治疗AP候选预测靶点的筛选：通过TCMSP数据库收集候选化合物对应的蛋白靶标，利用TTD数据库和DrugBank数据库检索与AP相关的疾病蛋白。两者的共同基因即为CSS治疗AP的候选预测靶点。

2.3 基因本体论(GO)与KEGG通路富集分析：通过STRING数据库对候选预测靶点进行GO和KEGG信号通路富集分析。通过错误发现率(FDR)筛选出主要相关的生物学功能和信号通路。

2.4 分子对接及“成分-靶点”网络互作图：利用Discovery studio 3.0 软件对候选成分和候选预测靶点进行分子对接，通过定位小分子化合物与蛋白的活性位点，找到结合最优构象，对受体与配体的亲和力进行计算并打分。筛选出比原有小分子和靶点结合高的分数，说明此成分与该靶点亲和力好。通过Cytoscape 3.7.2软件绘制“活性成分-作用靶点”网络互作图。

结 果

1 CSS候选成分数据库 利用TCMSP数据库检索CSS全方成分，通过设置OB、DL、HL阈值，筛选出54个化学成分。检索文献中报道较多的成分[5]，分别为柴胡皂苷A、柴胡皂苷B、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯A、洋川芎内酯I、川芎嗪、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸、甘草次酸、甘草素。纳入其中，整理所得共68个活性化合物，即为CSS的候选活性化合物。见表1。

表1 CSS 活性化合物信息

2 AP候选预测靶点的筛选 通过TCMSP收集68个活性化合物对应靶点，去重得到249个蛋白靶标，与TTD数据库和DrugBank数据库去重所得354个蛋白靶标进行比对取交集，利用韦恩图展示疾病靶点与成分靶点之间交集情况(图1)，红色代表AP靶点，绿色代表CSS靶点，重叠部分为共同靶点。共得到25个交集靶点，分别为PRKCA、PPARG、PTGS1、PTGS2、MAPK14、MAPK8、MAPK1、MAPK10、GSK3B、PTGES、MDM2、APP、CASP3、CASP7、IL6、ACHE、BCL2、BCL2L1、IKBKB、AKT1、CHEK2、HMOX1、VEGFA、MCL1、RAF1，用于后续网络药理学分析。

图1 CSS-AP共同基因靶点图

3 GO与KEGG富集分析 将25个预测蛋白导入STRING数据库，物种选Homo sapiens，为提高确率，置信度设置为0.9，共包含25个节点，46条边的蛋白质相互作用网络图(PPI)(图2)。同时，对预测蛋白进行GO分析，选取FDR排名前10名的条目建立柱状图(图3)，蓝色为生物过程，粉色为细胞组成，黄色为分子功能。对预测蛋白进行KEGG通路分析并采用Cytoscape软件展示FDR前20名的通路的蛋白富集情况(图4)，结果显示，蛋白较多富集在癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡信号通路、AGE-RAGE信号通路和TNF信号通路等，说明CSS的活性成分可通过这些通路来干预急性胰腺炎。

图2 蛋白相互作用网络图(PPI)

图3 FDR前10名GO分析

图4 FDR前20名蛋白-通路关系图

4 分子对接及“成分-靶点”网络互作图 应用Discovery Studio软件对68个候选成分和25个预测靶点进行虚拟对接。甘草作为使药，起调和诸药作用，故只筛选分子对接结果较好的三个成分甘草苷、光甘草宁、甘草宁H，利用Cytoscape可视化，对31个成分和25个蛋白靶标作成分-蛋白关系互作图(图5)。共有56个节点和289条边，其中，对接较好的活性成分为柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、叶酸、柚皮苷、橙皮苷和甘草苷分别能与18、18、20、20、18、17个蛋白对接成功。柴胡皂苷C和柴胡皂苷D为柴胡的主要成分，叶酸为川芎的活性成分，柚皮苷为枳壳成分，橙皮苷为陈皮成分，甘草苷为甘草成分。BCL2L1、PTGS2、MCL1、RAF1、IL-6、AKT1在对接结果中与较多成分显示出亲和力，分别能与60、47、45、44、41、40个成分对接成功，为CSS治疗AP中较重要的靶点。

图5 31个成分和25个蛋白靶标成分-蛋白关系图

讨 论

本研究通过网络药理学技术对CSS治疗AP的作用机制进行了较系统地分析。由分子对接我们可以看到CSS对AP涉及的蛋白靶标主要有BCL2L1、PTGS2、MCL1、RAF1、IL-6、AKT1等。PTGS2参与了急性胰腺炎的发生和发展，重症急性胰腺炎时PTGS2显示高表达[9-10]。抑凋亡细胞MCL1可抑制胰腺导管上皮细胞凋亡，在急性胰腺炎后期组织愈合过程中起主要作用[11]。抗氧化，抗炎和抗凋亡特性可有效改善急性胰腺炎的症状，BCL2L1是重要的抗凋亡分子。在AP发展过程中，IL-6上调可导致严重的炎症反应，AKT1则与控制腺泡细胞增殖和腺泡向导管化生密切相关[12-13]。

AP的发病与炎性和细胞凋亡密不可分，轻症急性胰腺炎中细胞凋亡现象广泛存在[14]。柴胡皂苷具有诱导癌细胞分化和凋亡，抑制细胞生长的特性[15]。Lee等[16]发现柴胡皂苷C可有效抑制细菌脂多糖诱导的凋亡细胞死亡，而细菌脂多糖为炎症的重要介质可用来观察AP的病程，柴胡皂苷D可降低炎症因子IL-6的表达[17]。叶酸是一类人体必需的B族维生素，在人体代谢循环，细胞生长、分化、修复和宿主防御等方面扮演重要角色。CSS中的橙皮苷、柚皮苷、甘草苷作为黄酮类化合物同样具有良好的抗炎镇痛作用，在临床可用来治疗病原微生物引起的炎症疾病及脓肿溃疡等疾病[18]。

综上所述，研究发现CSS可能作用于BCL2L1、PTGS2、MCL1、RAF1、IL-6、AKT1等多个靶点，通过癌症、PI3K-Akt、细胞凋亡、AGE-RAGE等信号通路来调控炎症、细胞凋亡及免疫水平。柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、叶酸、柚皮苷、橙皮苷和甘草苷很可能是CSS主要的多效活性化合物。该研究为深入探讨CSS治疗AP的作用机制提供了新思路。