电针结合传统针刺百会、大椎穴对脑缺血模型大鼠GAP-43表达的影响*

惠建荣，羊 璞，赵 娴 ，庞苗苗，惠建安，王院春

1.陕西中医药大学针灸推拿学院(咸阳712046)；2.陕西中医药大学附属医院(咸阳712000)；3.武警陕西省总队医院(西安710054)；4.陕西省富平县第二人民医院(富平714000)

缺血性脑血管病(Ischemic cerebral vascular disease,ICVD)是脑内血管阻塞引起的局部脑血流量减少，缺血中心区域细胞处于缺血缺氧状态，从而导致细胞大量凋亡，神经组织缺损的一种疾病，包含两种类型为缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作，其中最常见的为脑卒中，约占所有缺血性脑血管病的86%，具有高发病率、高致残率、高复发率和高死亡率的特点，严重危害人类的健康和生活质量。据报道，脑血管病(又称卒中)是近年导致我国公民死亡的主要原因之一[1]。根据流行病学调查结果显示，我国每年有150万～200万新发脑血管病的病例，现有脑血管病患者700余万人，其中约70%为缺血性脑血管病[2]。针灸治疗缺血性脑卒中已经得到证实与推广[3]。本研究选用百会、大椎，从分子水平研究针刺促脑缺血后神经再生的作用机制，探讨针刺对脑缺血大鼠脑内神经再生相关信号GAP-43蛋白的影响，为深入研究脑缺血后神经再生的治疗方法奠定基础。

材料及方法

1 材料选取及针刺取穴方法 选取健康成年SPF级雄性SD大鼠150只，体重230～270 g，由西安交通大学医学动物中心提供。针刺取穴：百会(DU20)、大椎(DU14)，定位参考照大鼠的常用针灸穴位：“百会”位于顶骨正中,“大椎”在第7颈椎与第1胸椎间，背部正中。以1寸毫针(0.3 mm×25 mm)向后平刺百会0.5寸，直刺大椎0.3寸。

2 模型制备 采用栓线法制作大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，将大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(剂量为0.35 ml/100 g)后仰卧固定在手术台上。切开大鼠颈部正中皮肤及浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，分别分离左侧颈总动脉及颈外动脉、颈内动脉，将鱼线线栓头用硅胶包裹，用制备好的鱼线沿颈外动脉插至颈内动脉。动物清醒后采用Bederson法进行神经功能缺损评分，评分1～3分者为模型成功[4]。

3 分组及干预方法

3.1 模型分组：模型制备成功后按随机区组化法分为四组:模型组、电针组、传统针刺组、电针结合传统针刺组，每组各30只。各组又随机平均分为术后3 d、7 d、21 d 3个不同时段亚组，同时设立假手术组30只。

3.2 干预方法：模型组术后不予处理；电针组予针刺入穴位后电针干预，接G6805-2型电针仪，采用连续波，频率120次/min，电流强度1 mA,输出电压2～4 V，以大鼠耐受且局部组织轻微颤抖为度，每天干预1次，每次干预时间为30 min[5]；针刺组予针刺干预，每次针刺入穴位后，每隔5 min捻转行针1次，头针频率200次/min，体针80次/min，每天干预1次，每次留针30 min；电针结合传统针刺组，行电针及传统针刺方法，每日1次。假手术组30只作实验大鼠大脑中动脉的充分暴露，不予栓线。

4 观察指标

4.1 大鼠神经功能缺损评分：各组大鼠在造模后3 d、7 d、21 d 3个不同时段采用修正神经功能缺损评分(Neurological severity scores,NSS)对其进行神经功能评估。神经功能依据其受损程度分为0～18分，0分即为正常，18分即为最严重的神经功能缺失。NSS根据一系列的运动、感觉、反射及平衡试验等进行评分。实验动物不能完成规定的动作或者反射即给1分，因此评分越高，其神经功能损害越严重[5]。

4.2 脑组织的病理改变及免疫组化检测：各组大鼠分别于3 d、7 d、21 d 3个不同时段，3个时间点随机取10只。用6%水合氯醛腹腔内注射麻醉后固定于手术台，剪开胸腔，仔细剪开心包膜，暴露心脏，在心尖处剪一小切口，用9#针头插入左心室，灌注0.9%生理盐水，剪开右心耳让血液流出，至右心耳流出液为无色透明时开始用4%多聚甲醛灌注固定。固定后立即剖颅取脑，在视交叉处切开,冠状切取 2 mm 厚包含梗死灶区域及左右半球的组织块浸于4%多聚甲醛中再固定。在梗死区取约0.5 mm厚脑组织50%、75%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水；二甲苯透明；浸蜡包埋；连续冠状切片，切片厚5 μm。切片备用并进行HE染色及免疫组化染色检查。最后 Olympus BX51显微镜观察并摄片，采用JD801形态学图像分析系统进行分析[6]。

结 果

1 大鼠神经功能缺损评分 实验结果见表1。假手术组大鼠各时间段神经功能未见明显异常，评分为0分，各时间段模型组神经功能评分与假手术组比较显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。在各时间段其他组与模型组比较，电针组、传统针刺组、电针结合传统针刺组神经功能缺损评分均较模型组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；术后第7天和第21天，与电针组、传统针刺组比较，电针结合传统针刺组大鼠神经功能缺损评分降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2 各组不同时点脑组织GAP-43蛋白的免疫组化表达情况 免疫组化检测缺血周边区GAP-43的表达情况见表2。各时间段模型组脑组织GAP-43蛋白的免疫组化表达与假手术组比较显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。在各时间段其他组与模型组比较，电针组、传统针刺组、电针结合传统针刺组大鼠相应区域GAP-43免疫活性较模型组GAP-43免疫活性增高，差异具有统计学意义(P<0.05)；术后第3天、第7天和第21天，与电针组、传统针刺组比较，电针结合传统针刺大鼠GAP-43免疫活性显著增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较(分)

注：与模型组比较，△P<0.05；与电针组比较，▲P <0.05；与传统针刺组比较，#P<0.05；与假手术组比较，*P<0.05

表2 各组大鼠不同时点脑组织GAP-43蛋白免疫组化表达情况比较(nmol/ml)

注：与模型组比较，△P<0.05；与电针组比较，▲P<0.05；与传统针刺组比较，#P<0.05；与假手术组比较，*P<0.05

讨 论

缺血性脑血管病属于中医“中风”范畴[7]，基本病机为气血逆乱、脑脉痹阻或血溢于脑所致，其病位主要在脑。《难经·二十八难》云：“督脉者，起于下极之输，并于脊里，上至风府，入属于脑。”并且督脉为阳脉之海，总督一身之阳，其循行入属于脑，因此，督脉与脑的关系非常密切。“经脉所过、主治所及”，经穴具有治疗其经脉所过部位脏腑、组织及联系器官的疾病。所以督脉擅长治疗神经系统相关疾病；选用督脉腧穴百会、大椎治疗中风，具有通利枢机、开窍醒神、滋阴抑阳、活血化瘀、益肾补髓等作用，使功能得复。

GAP-43为神经组织特异性磷酸蛋白，表达在发育或再生轴突的生长锥末端，可促进神经细胞生长、轴突再生和突触重构，是轴突生长分子标志蛋白，中枢神经损伤后，GAP-43在脑组织中呈现高表达，与神经系统的发育、突触形成和可塑性以及神经再生有着密切的关系[8-10]。ICVD会严重损害中枢神经系统，众多学者认为GAP-43是研究脑损伤修复的首选标志物之一[6,11-12]，针刺对促进ICVD后神经修复具有较好的治疗作用，笔者前期采用针刺治疗ICVD患者取得了较好的临床疗效[13]，但机制还不明确。

本研究发现，电针组、传统针刺组、电针结合传统针刺组均可促进脑缺血大鼠神经功能恢复，以及促进脑损伤周围存活的神经元轴突末梢的GAP-43蛋白表达，且电针结合传统针刺组较电针组及传统针刺组的效果更佳，其作用可能是与针刺刺激能够调节缺血区脑细胞内离子通道和离子含量有关[14-15]。因此，基于“督脉入属于脑”理论针刺百会、大椎穴对脑缺血大鼠脑内神经再生相关信号GAP-43蛋白的表达具有提高的作用。

综上所述，电针结合传统针刺百会、大椎可以促进GAP-43阳性细胞的表达，进而改善脑缺血大鼠神经功能，促进缺血区的神经修复，可能与针刺调控细胞内离子通道和离子含量相关，促进脑神经的重塑。由此，基于“督脉入属于脑”理论针刺百会、大椎穴可有效地提高ICVD大鼠神经再生相关信号GAP-43蛋白的表达水平，在防治ICVD上具有一定作用。