升阳益胃汤对溃疡性结肠炎模型大鼠HIF-1、TAK-1表达的影响*

杨 阔，韩 毅，刘华一△，路理杰，王秀娟

1.天津市中医药研究院附属医院(天津 300120)；2.天津中医药大学(天津 300193)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)多见于20～40岁[1]，据流行病学调查，我国目前UC发病率为11.6/10万[2-3]，而且有证据表明成逐年上升趋势[4]。临床以腹痛、腹泻、黏液脓血便和里急后重为主要症状，该病迁延难愈，极易复发，且有癌变倾向，严重影响生活质量，已被WHO列为现代难治病之一[5-7]。中医药治疗溃疡性结肠炎疗效显著，复发率低，并且有长期疗效好及副作用少等优势。HIF-1、TAK-1通路是重要的炎症信号，本实验采用升阳益胃汤干预UC大鼠模型，并观察HIF-1、TAK-1表达。

材料与方法

1 实验动物 Wistar大鼠36只，体重(200±20)g，雌雄各半，购自北京维通利华实验有限公司。

2 主要试剂 升阳益胃汤(黄芪、人参、半夏、白术、茯苓、橘皮、甘草、防风、羌活、独活、柴胡、泽泻、白芍、黄连)由我院制剂室提供，煎煮前加10倍量蒸馏水浸泡30 min，按常规煎药法煎煮2次，每次30 min，过滤药液并浓缩至每1 ml药液含生药2 g，经高压灭菌冷却，放置于4 ℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度。柳氮磺吡啶肠溶片(SASP)(上海信谊嘉华药业有限公司)，5%葡聚糖硫酸钠溶液(天津市铎辉生物医药有限公司)。苏木素-伊红染色试剂盒购自天津百浩生物科技有限公司，HIF-1、TAK-1抗体及试剂盒购自天津市铎辉生物医药有限公司。

3 溃疡性结肠炎大鼠模型建立 动物随机分为两组，即正常对照组6只和模型组30只。造模成功后，模型组再分为：模型对照组6只；升阳益胃汤高剂量组6只、中剂量组6只、低剂量组6只；西药组6只。

造模方法：首先把大鼠在SPF级动物房适应性喂养7 d，然后正常对照组给予消毒蒸馏水自由饮用10 d。模型组采用5%葡聚糖硫酸钠溶液灌胃，常规饮食不变，连续21 d。

4 动物分组与给药 中药用升阳益胃汤煎剂，大鼠用药量根据《药理实验方法学》人和动物间按体表面积折算的等效计量以及高、中、低剂量计算法确定。升阳益胃汤高剂量组(22 g/kg)、升阳益胃汤中剂量组(11 g/kg)、升阳益胃汤低剂量组(5.5 g/kg)、西药组(0.2 g/kg)，采取灌胃途径按各组药物剂量给药，连续28 d；模型对照组和正常对照组给予等容的蒸馏水灌胃，连续28 d。

实验步骤：各组大鼠先适应性喂养1周。1周后除正常组外其余各组大鼠均开始造模。第4周开始，中药组及西药组按各自剂量采取灌胃途径给药；模型对照组和正常对照组给予等容的蒸馏水灌胃。连续28 d后，将大鼠麻醉取材，检测指标。

5 标本采集与处理 末次灌胃结束后各组大鼠禁食不禁水24 h，然后麻醉，固定，剖取整个结肠组织，并沿纵轴剪开，清洗干净。截取病变结肠组织中的一部分，放置于4%多聚甲醛溶液中固定，然后制成病理切片；剩余的病变结肠组织置于做好标记的离心管中，于-80℃保存，用于Elisa检测。

6 疾病活动指数(DAI) 大鼠体重下降：<1% 为0分，1% ～5%为1分，5%～10%为2分，10%～15% 为3分，> 15% 为4分；大便黏稠度：正常为0分，松散的大便为2分，腹泻为4分；大便出血：正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分；综合以上三种情况进行综合评分，其总分除以3即为DAI。

7 结肠组织HE染色 取大鼠结肠组织，OCT包埋，液氮中保存，机器切片，浸蜡，DAB 显色，苏木素复染、脱水、封片、镜检，HE染色后显微镜下观察。

8 电镜检查 电镜下观察各组大鼠结肠组织的超微结构，检查其损伤及恢复情况。

9 结肠HIF-1、TAK-1表达水平 采用双抗体夹心酶标免疫分析法(ELISA)检测大鼠结肠组织HIF-1、TAK-1表达水平的影响。

10 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件分析，定量资料用均数±标准差描述，组间差异采用单因素方差分析比较。本文所有检验均为双侧检验，结果以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 升阳益胃汤对UC大鼠疾病活动指数(DAI)的影响 与正常组比较，模型组大鼠DAI显著升高(P<0.05)；干预组中，西药组可以降低大鼠DAI(P<0.05)，升阳益胃汤组显示与西药组相同的作用，且存在一定的量效关系。见表1。

表1 升阳益胃汤对UC大鼠疾病活动指数的影响

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2 升阳益胃汤对UC大鼠结肠组织病理变化的影响

2.1 HE染色：正常组黏膜层上皮结构完整，黏膜固有层无炎细胞浸润，黏膜下层无充血、水肿，无炎细胞浸润；模型组：多数黏膜层和肌层变薄，炎症现象明显，腺体萎缩，可见淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞。与模型组比较，西药组、升阳益胃汤组上述病理改变均减轻，且升阳益胃汤高剂量组效果更为显著(图1)。

2.2 电镜：正常组肠黏膜上皮细胞排列整齐，紧密。肠腔微绒毛完整，排列整齐，大小一致。上皮细胞间缝隙链接丰富，胞浆内细胞器丰富。模型组：肠黏膜上皮细胞排列疏松，肠腔游离缘不整齐，大部分微绒毛脱落，残存的微绒毛零星分布，且大小不一，排列紊乱。胞浆内部分线粒体出现肿胀，嵴消失，呈空泡状。升阳益胃汤低剂量组：同模型组。升阳益胃汤中剂量组：细胞排列较为整齐，肠绒毛部分恢复，数量较多，但仍存在大小不一，排列整齐欠佳，线粒体基本完好，个别出现肿胀，嵴断裂。升阳益胃汤高剂量组：比中剂量组较好同正常组。西药组：同正常组(图2)。

图1 升阳益胃汤对UC大鼠结肠组织病理变化的影响(HE染色，×100)

图2 升阳益胃汤对UC大鼠结肠组织电镜变化的影响(80kV，×26500)

3 升阳益胃汤对UC大鼠结肠HIF-1、TAK-1表达的影响 HIF-1：模型组和西药组与正常对照组比较显著升高(P<0.05)；西药组和升阳益胃汤组高、中、低剂量组均模型组显著降低(P<0.05)；升阳益胃汤高、中、低剂量组均较西药组显著降低(P<0.05)。

TAK-1：模型组、西药组、升阳益胃汤低、高剂量组均较正常对照组显著升高(P<0.05)；升阳益胃汤低、中剂量组较模型组显著降低(P<0.05)；升阳益胃汤中剂量组较西药组、升阳益胃汤低、高剂量组TAK-1均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 UC大鼠结肠HIF-1、TAK-1表达(pg/ml)

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与西药组比较，△P<0.05

讨 论

溃疡性结肠炎属中医学“泄泻”“肠风”“肠澼”“下利”“久痢”“休息痢”“滞下”等范畴，现代医家多认为本病为本虚标实之证。本虚多为脾虚、肾虚；标实则为湿、毒、瘀、热。临床上治疗原则为扶正祛邪，分别采用健脾补肾，清热祛湿，解毒化瘀等方法予以治疗[8-12]。 “阴火”理论为李东垣创立，“阴火”一词首见于《内外伤辨惑论》，又在《脾胃论》中阐发。阴火理论则是内伤脾胃学说的核心内容，脾胃内伤，清阳下陷，气虚发热，是阴火产生的根本原因；以补益脾胃，升清脾阳，清降阴火为治疗原则。溃疡性结肠炎虽病位在大肠，但与脾脏关系密切。从“阴火”理论论治本病，实质是从脾胃入手，调畅气机升降，兼以清热化湿，切合溃疡性结肠炎病机及治疗原则。升阳益胃汤为“阴火”理论的代表方剂，出自《内外伤辨惑论》,黄芪为君，人参、半夏、白术、茯苓、橘皮、甘草为臣，防风、羌活、独活、柴胡、泽泻为使，白芍、黄连为佐。组方升降、寒温并用，除湿与和营并用，复合脾胃之水谷纳运相得、气机升降相因、阴阳燥湿相济之生理机能。诸药合用补中有散，发中有收，使气足阳升，正旺而邪祛，共奏益气升阳、升清降浊、清热除湿、解毒之功效。

低氧诱导因子(HIF-1)与TAK-1均与炎症反应密切相关。在动脉硬化、关节炎等自身免疫性疾病患者的炎症部位都发现了低氧环境和HIF的激活，在中性粒细胞、巨噬细胞和一些非免疫细胞中发现，HIF可以激活NF-κB等炎症因子[13-14]。研究发现，活化的TAK-1可激活NF-κB和JNK/SAPK两条炎症通路，导致一系列相关基因的表达，产生致炎因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等，从而导致肠道黏膜的炎症反应[15]。本实验也证实，HIF-1与TAK-1 UC的发病密切相关。治疗后，HIF-1与TAK-1均明显降低，说明两指标与炎症的程度成正相关性。

综上，本实验研究显示升阳益胃汤可降低溃疡性结肠炎大鼠HIF-1和TAK-1的表达，抑制炎症的反应，从而对本病起到治疗作用，且有一定的量效关系。