SRB分离鉴定及处理冶金酸性废水中铬的实验研究

张 颖，李喜林，李致格，张富隆

(1.滁州学院 土木与建筑工程学院，安徽 滁州 239000；2.辽宁工程技术大学 土木工程学院，辽宁 阜新 123000；3.北京世源希达工程技术有限公司，北京 100080)

冶金行业的不断发展导致冶金的生产流程较复杂，产生的废水所含污染物越来越多[1]，如：轧钢等金属加工过程会产生大量的酸性废水，包括废酸和工件冲洗水。金属中掺加铬会提高金属的机械性能，这导致冶金行业中会有大量的铬流失。自然界中，铬以Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的形式存在[2，3]，其中Cr(Ⅵ)是一种毒性很大的致突、致癌剂，通常认为其毒性要比Cr(Ⅲ)的高100倍[4]。硫酸盐还原菌(SRB)由于其具有处理费用低、处理污染物种类多等优点而得到了广泛的应用[5,6]，主要通过还原SO42-消耗水合氢离子、还原生成的S2-与重金属离子结合生成溶解度小的金属硫化物沉淀而使水质得到改善[7-9]。Wosiack[10]等人研究表明，SRB在厌氧条件下能有效还原废水中的SO42-，且能使金属离子达到有效去除。张鸿郭[11]等人研究表明固定化的硫酸盐还原菌对废水中Cr(VI)和SO42-的去除率分别为97.43%和99.30%。目前，国内外研究者已将其广泛应用在处理含重金属离子的工业废水、有机废水、城市生活废水、酸性地浸矿山地下水、酸性矿山废水等方面[12-14]。基于此，本实验从污水处理厂生化池中取得种样，通过对培养条件的优化，获得可以同时有效去除冶金废水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的厌氧优势菌属。

与一般的回归分析一样，二次回归正交设计预测值的方差随试验点在因子空间的位置不同(各因素所取水平不同)而呈现较大差异[15]，因而导致设计不能在各个方向均提供等精度的估计，于是不能对不同试验点预测值进行直接比较。由于误差的干扰，就不易根据预测值寻找最优区域[16]。为了克服这个缺点，本研究采用回归旋转设计。回归旋转设计，一方面，基本保持了回归正交设计优点，即实验次数少、计算简便，且部分地消除了回归系数间的相关性[17]；另一方面，能使二次回归设计具有旋转性。利用具有旋转性的回归方程进行预测时，对于同一球面上的点可直接比较其预测值的好坏，从而易于找出预测值较优区域[18]。

综上所述，实验选用阜新市皮革园区生化池获得的液体菌种作为SRB的筛选样品，基于微生物的分离鉴定及其特性研究手段，获得优势SRB菌株进而研究不同反应条件下SRB对废水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果，并通过回归旋转实验进一步确定最优实验条件。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

菌株筛选样品取自阜新市皮革园区生化池。实验所用的KNO3、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaSO4·2H2O、柠檬酸钠、结晶紫、草酸铵、碘化钾、孔雀绿、番红、乙醇、重铬酸钾、硝酸铬高锰酸钾等均为分析纯。

实验仪器：YXQ-LS-18SI型手提式压力蒸汽灭菌锅、HPS-280型生化培养箱、VD-650型超净工作台、XS-212型光学显微镜、pHS-3C型精密pH计、TG-328A型电子天平、UV756PC型721分光光度计。

富集培养基的配置：KNO31 g/L，Na2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，FeSO4·7H2O 0.5 g/L，CaSO4·2H2O 0.5 g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，柠檬酸钠3 g/L，蒸馏水1 L，pH=8，121℃灭菌20 min。固体培养基：在富集培养基中加入2%的琼脂。121℃灭菌20 min。

模拟冶金酸性废水的配置：Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的浓度分别为50 mg/L、10 mg/L、500 mg/L，溶液pH=5。

1.2 实验方法

1.2.1 水质指标测定方法

利用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr(VI)。高锰酸钾氧化-二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr(Ⅲ)。铬酸钡分光光度法测定SO42-，玻璃电极法测定pH。

1.2.2 菌株驯化、筛选和分类方法

对菌株进行耐铬能力驯化，使菌株能够在含有Cr(VI)和Cr(Ⅲ)的废水中生长。最初阶段先加入浓度为10 mg/L的Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)，使细菌逐渐适应生长环境，一周后加大Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)投加量，以后每周依次加入50、80、120、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L，使其能够逐渐适应高浓度的环境；稀释涂布-叠皿夹层法对SRB纯化分离；镜检法对SRB进行鉴定。

1.2.3 SRB处理废水的方法

取6份200 mL配置好的含Cr(VI)50 mg/L、Cr(Ⅲ)10 mg/L、SO42-500 mg/L的水样，调节pH=7，分别加入不同体积比的处于对数期的经过驯化、分离SRB(细菌计数得到菌液对数期的菌密度为3×108个/mL)，置于35℃厌氧培养箱中充分反应24 h后，将其置于离心机转速为4000 r/min条件下，离心处理30 min，取上清液测定Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-浓度，并计算其去除率，确定最佳SRB投加量。以同样的方法分别控制不同pH、反应时间、反应温度，测定Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-浓度，确定最佳反应pH、时间和温度。

1.2.4 去除率的计算方法

按照上述方法测定在不同SRB投加量、反应时间、反应温度条件下，处理后的冶金废水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的浓度，并通过式(1)计算出各个污染物的去除率。

(1)

式中：y：去除率，100%；

c1：处理前污染离子的浓度，mg/L；

c2：处理后污染离子的浓度，mg/L。

1.2.5 正交旋转组合设计方法

选取SRB投加量、反应时间、反应温度3因素，展开3因素正交旋转组合设计，对SRB处理酸性冶金废水中铬的效果进行优化，对因素水平进行编码，结果见表1所示。

表1 实验的因素水平编码表

*Z1SRB投加量；Z2反应时间；Z3反应温度

2 结果与分析

2.1 SRB分离纯化及驯化鉴定结果

采用叠皿-夹层培养法对驯化后的耐铬细菌进行纯化分离，在35 ℃的培养箱中培养3 d时菌落形态如图1所示。这是因为硫酸盐还原菌代谢产生的H2S与培养基中的Fe2+反应生成黑色FeS沉淀所致[19]。选取形态单一的菌落置于灭菌消毒处理后的培养基中富集培养5 d后，溶液变为墨汁色，并产生大量的臭鸡蛋气味的气体，说明SRB已经适应环境，能够在500 mg/L的高浓度含铬废水中存活。

图1 细菌的富集培养图

在1600倍油镜下镜检革兰氏染色和经番红复染的芽孢染色的结果分别如图2a、2b所示，结果发现SRB均被染为红色，所以初步判断该菌属无芽孢、呈阴性；在1600倍的油镜下观察到的细菌的鞭毛染色结果由图3a所示，可知菌株是极生鞭毛；纯化后的SRB透射电镜放大30000倍的检测结果如图3b所示，可明显看出该菌株呈杆状，且具有鞭毛。

a.革兰氏染色图 b.芽孢染色图

图2细菌染色结果图

a.鞭毛染色图 b.透射电镜检测图

图3细菌镜检结果图

分别将菌株在好氧和厌氧条件下培养3 d后进行基因测序，得到两种条件下培养菌株的DNA测序结果相同，说明培养的菌株属于兼性厌氧菌。通过对该菌株的基因测序以及通过BLAST基因库比对、序列同源性分析可看出，该兼性厌氧菌与Citrobacter amalonaticus TB10的相似性最高，相似度达99.93%，说明该菌株与Citrobacter amalonaticus TB10属于同一性质的菌株，均为柠檬酸性杆菌。并利用MEGA 6.0软件得到所测菌株序列与其他物质的亲缘关系，得到的进化树结果如图4所示。

图4 菌株的系统进化树

2.2 SRB对冶金酸性废水去除效果

2.2.1 SRB投加量对污染物去除率的影响

不同体积比的SRB条件下对Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如图5所示。可看出，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率均随着SRB投加量的增加逐渐增大，在SRB投加体积比为1.5%时，Cr(Ⅲ)的去除率较低为9.5%，Cr(VI)的去除率较高为67.8%，这是由于SRB将溶液中的Cr(VI)还原为大量的Cr(Ⅲ)，使溶液中Cr(Ⅲ)的浓度增大，而当SRB菌足够多为3%时，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分别为95.8%、68.7%、70.8%，这是因为SRB将溶液中的Cr(VI)还原Cr(Ⅲ)，将SO42-还原为S2-，S2-与Cr(Ⅲ)发生双水解反应，生成Cr(OH)3沉淀，使得Cr(Ⅲ)的浓度降低。当SRB投加量继续增大时，去除率增加不明显，综合考虑确定最佳的投加量为3%。

图5 SRB投加量对污染物的去除影响

2.2.2 初始pH对污染物去除率的影响

不同pH条件下对Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如图6所示。可看出，随着pH的逐渐增大，Cr(Ⅲ)的去除率逐渐增大，而Cr(VI)、SO42-的去除率在pH>7时逐渐下降，在pH=7时去除率最大，分别为95.8%、70.8%，说明SRB为中性菌，在pH值为7时活性最好；Cr(Ⅲ)随着pH增大一直呈现上升趋势，且在pH>7时上升的更快，这是因为pH>7溶液中Cr(VI)被还原成Cr(Ⅲ)的量少，而溶液中Cr(Ⅲ)除了与S2-发生双水解反应，还可以与溶液中的OH-形成沉淀，所以去除率较大。

图6 pH值对污染物的去除影响

2.2.3 反应时间对污染物去除率的影响

不同反应时间下SRB对Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如图7所示。可看出，在反应进行0.5 d～2.5 d时，对Cr(VI)、SO42-的去除率由10.8%增加到95.2%，对Cr(Ⅲ)的去除率由7.9%增加到67.2%，对SO42-的去除率由16.7%增加到68.4%，可见，该阶段的SRB处于对数生长期，随着接触时间的增长，反应进行的越完全。在反应进行3d时Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除率即可达到最大，分别为95.8%、68.7%、70.8%。

图7 反应时间对污染物的去除影响

2.2.4 反应温度对污染物去除率的影响

不同反应温度下SRB对Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如图8所示。可看出，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率在温度为35℃时达到最大值，分别为95.8%、68.7%、70.8%，说明SRB受温度影响，35℃可使SRB保持最佳的活性，温度过高或者过低会影响到SRB的活性，导致Cr(VI)和SO42-的还原量减少，Cr(VI)还原为Cr(Ⅲ)的量虽然减少，但是Cr(Ⅲ)的去除率也较低，是因为SO42-的还原量少使得生成的S2-量也少，从而S2-与Cr(Ⅲ)发生双水解的量也少，所以最佳的反应温度为35℃。

图8 温度对污染物的去除影响

2.3 二次回归正交旋转组合设计对污染物去除条件优化

建立SRB处理冶金酸性废水中铬实验的三元二次正交旋转设计回归方程，得到Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除率结果见表2所示。

表2 二次回归正交旋转组合试验设计及结果

*ya-SO42-去除率；yb-Cr(Ⅵ)去除率；yc-Cr(Ⅲ)去除率

经过二次方差分析剔除不显著项后，结果显示各项均达到显著水平，最后确定SO42-、Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的回归方程分别为：

(2)

(3)

(4)

在3个实验因素的编码范围[-1.682,1.682]内，通过Excel规划求解，得到：当x1=3.3，x2=3.4，x3=34，即SRB投加量为3.3%、反应时间为3.4 d、反应温度为34 ℃时，SO42-、Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的去除率分别可达到理论值69.78%、100%、65.46%。

3 结论

(1)通过对细菌进行纯化培养以及革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、TEM分析、基因测序等鉴定手段，得到该菌株无芽孢、有鞭毛、为柠檬酸性杆菌、生化类型为兼性厌氧型。

(2)SRB处理200 mL含Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的冶金酸性废水结果发现：SRB菌悬液体积比为3%(细菌计数得到菌液的菌密度为3×108个/mL)、pH=7、反应温度为35℃、反应进行3 d时，对Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分别为95.8%、68.7%、70.8%，说明该菌株为耐铬、嗜中温、中性菌。

(3)回归正交旋转实验对SRB处理冶金酸性废水的条件优化结果表明：当SRB投加体积比3.3%(细菌计数得到菌液对数期的菌密度为3×108个/mL)、反应时间为3.4 d、反应温度为34 ℃时，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分别可达到理论值100%、65.46%、69.78%。