京杭运河杭州段水体污染和细菌群落结构特征*

王 新 汤江武 吴逸飞 姚晓红 孙 宏 沈 琦

(浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021)

细菌在水生态系统生物地球化学循环过程中具有重要作用[1-3]，不同功能类群细菌组成的群落决定了生态功能的特性和强弱，是维持水生态系统平衡的关键因素[4]193,[5]38。细菌群落同时也是水生态系统中最为敏感并极易受环境影响的生物群落，其演替的过程，既是对物质转化和能量传递等生态功能变化的适应，也是对环境因子变化的生态响应。因此，研究细菌群落的结构和功能对了解水生态系统维持健康和平衡的机理非常重要[6]20404。

诸多环境因子如pH、温度、营养盐、有机质成分、污染物等均与水体细菌群落结构的变化有直接关系[7-11]。不同生境中的细菌群落结构是多种环境因子共同作用的结果。目前淡水微生物生态的研究中，已有不少研究开始关注城市河流，水质、环境等因子与水体细菌的关系，人为扰动是影响这类水体细菌群落结构的重要原因之一[12-14]，[15]118,[16]1176。但由于这类水体的复杂性和多样性，仍需更多的研究来深化对城市河道微生物群落与环境因子关系的理解。相关研究的开展，对了解人类活动对水生态系统的影响，以及城市水生态系统的恢复和维护具有重要作用。

京杭运河杭州段自南向北贯穿杭州核心城区，汇集市区诸多城市河道，是杭州排洪防涝的骨干河道，具有重要的人文、景观和生态功能[17]1,[18]1581。尽管近年来进行了大规模的综合整治，但由于雨污分流不彻底，城市面源污染难以有效控制，京杭运河杭州段仍然是典型的易受城市生产、生活污染的河道。对该水体细菌群落与环境变化的研究，有助于了解京杭运河杭州段的水环境污染现状和水体微生态过程，为区域水环境污染防控和综合治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 采样位点和采样方法

分别于2015年1月20日(冬)、4月21日(春)、7月19日(夏)、10月26日(秋)，在京杭运河杭州段干流从上游向下游的顾家桥(30°17′4″N，120°12′19″E)、卖鱼桥(30°17′31″N，120°8′56″E)、拱宸桥(30°19′15″N，120°8′5″E)和义桥(30°22′33″N，120°7′27″E)4个位点分季节采样4次。采样位点如图1。由于京杭运河杭州段河道水体分层不明显，故仅采集表层样品进行研究。

1.2 样品的采集和处理

在采样现场用梅特勒SG98型多参数分析仪测定采样点的温度和溶解氧，用2 L 有机玻璃采水器采集表层河水(0～30 cm)1.5L，立即带回实验室处理。总菌计数样品经8 μm孔径滤膜过滤后取20 mL，用经0.22 μm孔径滤膜过滤的福尔马林(最终体积分数5%)固定，装入无菌样品瓶中，4 ℃保存。随后取0.3 L水样用0.22 μm孔径滤膜过滤收集菌体，滤膜用铝箔包裹，液氮速冻后装入冻存管，存于-80 ℃冰箱以备提取基因组DNA。剩余样品分别用于细菌胞外酶活性和水质参数的测定。

1.3 总菌计数和β-葡萄糖苷酶活性的测定

总菌计数采用荧光染色计数法[19]。β-葡萄糖苷酶活性的测定采用荧光模拟底物(FMS)法[20]进行，以胞外酶水解底物的速率来表示其活性，具体参照文献[21]、[22]描述的测定方法进行。

图1 采样位点示意图Fig.1 Sampling stations

1.4 细菌群落结构的聚合酶链式反应(PCR)-变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析

1.4.1 DNA提取

将收集了大量菌体的滤膜在无菌工作台中剪成碎片，采用PowerWater®DNA提取试剂盒提取水样中的基因组DNA。提取获得的DNA样品用超微量分光光度计(NanoDrop-2000)测定浓度后置于-20 ℃保存备用。

1.4.2 PCR-DGGE分析

以提取的样品的基因组DNA为模板，PCR扩增16S rDNA V3区片段，引物为连有GC-夹子(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3’)的Eubac341f (5’-TAC GGG AGG CAG CAG-3’)和Eubac517r (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)[23]，参考文献[21]描述的方法进行PCR扩增。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后用Bio-Rad公司的D-code System进行DGGE分析。聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性梯度为40%～60%。60 ℃、40 V条件下电泳1.5 h后升电压至120 V，电泳5.0 h。聚丙烯酰胺凝胶从电泳仪上取下之后，在EB染液中染色25 min，用TANNON-2500凝胶成像系统采集图像。

1.5 DGGE条带的回收、克隆、测序及分析

DGGE凝胶中的主要条带切下后用dd H2O冲洗，捣碎后用30 μL TE buffer 在4 ℃下浸泡12 h，PCR回收切下条带中的DNA。回收条带的PCR产物再次经DGGE检测以确保回收条带PCR产物的正确。PCR产物用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化后连入pMD18-T载体，转入大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5感受态细胞，采用菌落PCR检测阳性克隆，每个样品随机挑选3个载有插入片段的阳性克隆送交上海某公司测序。测序结果在GenBank中比对分析之后用MEGA 4.1软件以Neighbor-Joining法构建系统发育树，各分支的Bootstrap置信度用1 000次自导复制来评价。

1.6 细菌群落结构与环境因子关系分析

获得的DGGE图谱用Quantity One-1-D软件对DGGE条带进行数字化分析，用条带灰度大小来代替每个条带的扩增量，将不同泳道的条带组成一个数字化矩阵，进行均一化处理，以每个条带灰度占该泳道总灰度的百分比形成新的矩阵，消除各泳道上样量的差异。采用限制性排序分析细菌群落结构与温度、溶解氧、高锰酸盐指数、总氮、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮等环境因子之间的相互关系，由于去趋势对应分析(DCA)特征轴最大长度<3，故采用冗余分析(RDA)进行分析。

1.7 水质参数测定

高锰酸盐指数采用碱性高锰酸钾氧化法测定。硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮和总氮均采用气相分子吸收光谱法测定。

1.8 数据统计分析

采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，采用Tukey氏法多重比较检验。以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 水体环境和水质参数的季节变化

2.1.1 温度和溶解氧的季节变化

京杭运河杭州段冬季、春季、夏季和秋季的平均温度分别为(9.0±0.5)、(20.0±0.5)、(28.0±0.5)、(13.0±0.5) ℃，从上游的顾家桥到下游的义桥，各个采样点在相同季节的水温差异不显著。冬季、春季、夏季和秋季的溶解氧平均值分别为(7.76±0.50)、(5.17±0.44)、(1.60±0.43)、(5.44±0.32) mg/L，夏季溶解氧最低；各个采样点中，上游的顾家桥在4个季节中均最高。

2.1.2 水质的季节变化

各个季节高锰酸盐指数从上游到下游大体呈递增趋势(见图2)，义桥的高锰酸盐指数显著高于其他几个采样点。京杭运河流经杭州城区过程中污染物增加。

图2 高锰酸盐指数的季节变化Fig.2 The seasonal changes of permanganate index

其他水质指标的季节变化见图3。氨氮和总氮在4个季节，从上游到下游大体呈递增趋势，义桥的氨氮和总氮含量显著高于其他几个采样点。以平均值最高的冬季为例，顾家桥、卖鱼桥、拱宸桥、义桥的氨氮分别为1.11、1.34、2.39、3.40 mg/L，总氮分别为2.97、5.00、6.27、7.66 mg/L。各个采样点水样氨氮和总氮含量存在季节变化，但不具明显规律。总体上硝酸盐氮含量上游采样点高于下游，亚硝酸盐氮含量则具有和氨氮类似的变化趋势。上述数据表明，杭州城区污染物的输入，尤其是高锰酸盐指数和氨氮，对京杭运河的水质具有重要影响。

2.2 细菌丰度和胞外酶活性的季节变化

2.2.1 细菌丰度的季节变化特征

细菌丰度的季节变化如图4所示。从上游的顾家桥到下游的义桥，各位点细菌丰度除顾家桥在夏季偏高外，均呈显著上升趋势。以春季为例，顾家桥、卖鱼桥、拱宸桥、义桥的细菌丰度分别为3.62×106、5.88×106、6.39×106、8.53×106个/mL。这与京杭运河经过杭州城区过程中，可能存在外源生物、化学污染物的输入有关。在相同采样点的不同季节，细菌丰度在冬季和春季与夏季和秋季有着显著的差异。

2.2.2 细菌胞外酶活性季节变化特征

在不同季节，β-葡萄糖苷酶活性具有不同特征(见图5)。冬季从上游到下游的位点逐步递增，从顾家桥的0.378 μmol/(L·h)增至义桥的0.637 μmol/(L·h)；春季则逐步递减，从顾家桥的0.366 μmol/(L·h)减至义桥的0.186 μmol/(L·h)；秋季逐步增加，但各采样点的差异不显著；夏季则无明显变化特征。以平均值比较，β-葡萄糖苷酶活性在冬季显著高于其他季节，冬季平均值达0.511 μmol/(L·h)；而春季、夏季、秋季β-葡萄糖苷酶活性则无显著差异。

图3 氨氮、总氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的季节变化Fig.3 The seasonal changes of ammonia nitrogen,total nitrogen,nitrate nitrogen and nitrite nitrogen

图4 细菌丰度的季节变化Fig.4 The seasonal changes of bacteria abundance

2.3 细菌群落的季节变化

采用PCR-DGGE获得了16S rDNA V3区片段指纹图谱(见图6)。泳道中的不同条带表示不同种细菌操作分类单元(OTU)，条带数显示了水体细菌的多样性，尽管不同位点不同季节的DGGE指纹图谱在条带亮度上有差异，但细菌种类差异不大。

图5 β-葡萄糖苷酶活性季节变化Fig.5 The seasonal changes of β-D-glucosidase activity

对DGGE图谱中的主要条带进行了测序和分析，通过系统发育树分析显示了京杭运河杭州段水体中细菌的主要种类(见图7)。主要集中在变形菌门(Proteobacteria)(37.8%)、放线菌门(Actinobacteria)(24.3%)、拟杆菌门(Bacterioidetes)(18.9%)、厚壁菌门(Firmicutes)(10.8%)和蓝藻门(Cyanobacteria)(8.1%)几个细菌门中。而DGGE图谱中，条带7、15、29、31均属于黄杆菌(Flavobacterium)，条带18属于厚壁菌(Firmicutesbacterium)，条带30属于放线菌(Actinobacterium)，它们所代表的细菌是京杭运河杭州段水体中大多数时间的优势细菌。

采用限制性排序分析了细菌群落结构与环境因子之间的关系。所有位点中，义桥和顾家桥主要分布在第一、第二象限，拱宸桥和卖鱼桥主要分布第三、第四象限(见图8)。整体上来看，从上游的顾家桥到下游的义桥，水体细菌群落结构变化明显。溶解氧、硝酸盐氮含量与细菌群落结构差异性呈正相关，其他环境因子与之呈负相关。高锰酸盐指数和总氮是关键影响因子。

注：图谱中条带标记数字为切胶测序分析的条带编号。图中泳道标记A、B、C、D分别为义桥、拱宸桥、卖鱼桥、顾家桥，字母后数字1、2、3、4分别为冬季、春节、夏季、秋季，图8同。

图6 细菌16S rDNA V3区片段DGGE指纹图谱
Fig.6 DGGE profiles of 16S rDNA V3 fragments
of bacteria

3 讨 论

人类活动对水环境的影响多年来受到广泛的关注，城市作为人口的主要聚集区，生产、生活产生的污染物的输入，对城市河道乃至区域水环境的水质和水体生态都有着重要的影响[24]139,[25]。京杭运河杭州段自钱塘江引水，流经市区的过程中，由于地势低洼，汇纳了市区河网带来的各种污染物，更有诸多生活污水直排入河[17]1。万欢等[18]1586在2004年通过水体细菌种类的研究推断市区有机和无机污染物的输入相当严重。ZHANG等[24]141在2008—2013年对杭州地区河网的长期连续监测中发现，市区河道氨氮的浓度是其他区域河道的3～5倍，是区域氮污染的重要源头之一。近年来随着水污染治理工作的开展，生活污水截污纳管，其向河网的输入量大大减少，京杭运河杭州段水体水质明显好转。然而本研究中，从上游顾家桥到下游义桥，在各个季节，水体中的高锰酸盐指数、氨氮、总氮以及细菌丰度，大体呈递增趋势，充分说明由市区带来的污染仍然是京杭运河水体污染的重要原因。

图7 16S rDNA V3区片段PCR-DGGE切胶条带测序结果的系统发育树分析Fig.7 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences obtained by PCR-DGGE

图8 细菌群落结构与环境因子的RDA分析Fig.8 RDA analysis of bacterial community structure and environmental parameters

细菌是水体中对环境变化响应最为敏感、对污染物的转化和去除最为重要的功能类群，关系到水体生态系统的维持、修复和平衡，因而一直是研究的热点[5]46,[6]20404。水体中的胞外酶主要由细菌产生，大多数大分子有机物的转化过程必须有细菌胞外酶的参与才可能完成[26-27]，因此在一定程度上，细菌胞外酶的活性意味着细菌的活性[21]。本研究中水体β-葡萄糖苷酶活性冬季显著高于其他季节，而以4个位点的平均值计，冬季是细菌丰度和高锰酸盐指数、氨氮、总氮最高的季节，这也表明细菌的活性也对水体污染物的变化有明显的响应，水体细菌具有天然的污染去除和水体修复功能。

水体细菌实现其生态活性和生态功能的基础是其功能类群的组成[4]196。近年来，一些城市河道水体微生物群落结构和多样性的研究促进了人们对不同河道水体中细菌功能类群的认识。如南京秦淮河主要细菌种类是变形菌门、放线菌门和厚壁菌门[28]1165，赣江是变形菌门和放线菌门[29]385，美国南加州的一条城市河道中则是变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门(Acidobacteria)[16]1180。京杭运河杭州段水体主要细菌类群与多年来人们对淡水生态系统主要细菌类群的认识是一致的[30-32]。

不同河道水体细菌群落结构的差异，既是细菌对水体环境因子变化的响应，也是受到多种环境因子变化共同驱动的结果。CAI等[28]1165认为，温度、总氮、N/P和氨氮是秦淮河水体细菌群落结构的主要影响因素；WANG等[29]385认为，温度和流速是影响赣江南昌段水体细菌群落的主要环境因子；ZHANG等[15]118对上海市内3条河道的研究表明，温度、总溶解性固体(TDS)、pH和盐度均与细菌群落结构变化有关，其中温度是首要的影响因子。本研究对京杭运河杭州段的研究表明，高锰酸盐指数和总氮是主要的影响因素，而这两种污染物主要来源于京杭运河流经杭州市区的被动输入，这表明城市源对京杭运河杭州段的水体水质和生态系统有着关键的影响，京杭运河杭州段的水体污染治理，依赖于杭州城区点、面源污染的管理和控制。

4 结 论

(1) 京杭运河杭州段从上游顾家桥到下游义桥，高锰酸盐指数、氨氮和总氮、细菌丰度大体呈递增趋势，冬季水体总体污染水平及细菌丰度均显著高于其他季节。京杭运河流经杭州市区时的污染物被动输入是水体污染的主要原因。

(2) 京杭运河杭州段水体中细菌的主要种类集中在变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和蓝藻门等5个细菌门中，所占比例分别为37.8%、24.3%、18.9%、10.8%和8.1%，分别属于黄杆菌、厚壁菌和放线菌的细菌是京杭运河杭州段水体中大多数时间的优势细菌。

(3) 京杭运河杭州段水体细菌群落结构从上游到下游变化明显，高锰酸盐指数和总氮是影响细菌群落结构差异的关键因子。