活血化瘀中药抗同种异体移植排斥潜在活性成分与机制的网络药理学研究

曾玉群 邵丽娜 何强 戴振华

器官移植手术后的排斥反应是困扰器官移植发展的主要难题之一。免疫抑制剂的使用是器官移植界的重大突破，然而长期服用免疫抑制剂会导致多种毒副反应，例如导致感染、诱发肿瘤等[1]。因此，探索移植排斥的免疫机制，寻找新的药物作用靶点是抑制移植排斥和诱导移植物长期存活或免疫耐受的重要策略。

近几十年我国器官移植飞速发展，针对抗移植排斥的药物研究，祖国医学在动物与临床试验中取得了较大进展。多项研究显示中医药在抗移植免疫排斥以及减少免疫抑制剂不良反应方面具有良好的疗效[2]。目前中医理论认为器官移植后排斥反应会使机体处于气虚、血瘀、痰湿互结状态，相关中药被证明能抑制动物器官移植排斥反应，尤其是多个活血化瘀中药的抗排斥作用[3]。但中药成分复杂，靶点众多，机制不明，影响了进一步开发及其临床使用。

网络药理学是2007年英国药理学家Hopkins提出的概念，其基于系统生物学将药物分子、作用靶点及疾病3者的网络关系相连，从而研究药物治疗疾病的作用机制[4]。网络药理学为我国中医药的研发提供了新思路和新策略。本研究将利用网络药理学去挖掘活血化瘀中药作用于同种异体移植排斥的活性成分及其机制，为中医药抗器官移植排斥提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 数据来源 活血化瘀中药来源于《中药学》课本第十二章活血化瘀药[5]，共包括川芎、延胡索、郁金、姜黄、乳香、没药、丹参、红花、桃仁、益母草、泽兰、牛膝、鸡血藤、王不留行、月季花、凌霄花、凤仙花、土鳖虫、自然铜、苏木、骨碎补、血竭、儿茶、刘寄奴、莪术、三棱、水蛭、虻虫、斑蝥、穿山甲32味中药。中药活性成分来自BATMAN-TCM在线数据库[6]，同种异体移植排斥靶基因来自 PALM-IST[7]及 GeneCards数据库[8]。

1.2 中药活性化合物及靶标的筛选 采用BATMANTCM在线数据库[6]（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）检索获取中药活性成分及相关靶基因。BATMAN-TCM在线数据库是第一个专门为中药分子机制设计的在线生物信息学分析工具，目前被中医药领域广泛使用，其基于药物与药物、蛋白与蛋白相似性算法来预测每一种中药及方剂的潜在靶点。检索参数选择中药各化合物成分得分（Score Cut off）≥48 分，P≤0.05。

1.3 关键活性成分靶基因集的构建 利用PALM-IST[7]（http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm）及GeneCards[8]（https://www.genecards.org/）在线数据库，以“同种异体移植排斥（allograft rejection）”作为检索关键词，获取相关靶基因作为疾病病理靶标。同时与中药活性成分所预测的靶基因进行匹配，采用Cytoscape 3.3.0软件[9]构建活血化瘀中药关键活性化合物的靶基因集。最后使用STRING数据库[10]（http://string-db.org/），选择“homo sapiens（人类）”物种进行靶基因间相互作用分析。PALM-IST数据库是基于Pubmed的文献资源进行基因/蛋白名称、药物、疾病等生物实体及其相互关系提取的检索工具，其可根据文献的摘要进行数据检索挖掘。GeneCards数据库是目前使用最多的人类基因靶点集成数据库，其自动集成了150多个网络来源的基因数据，包括了基因组学、蛋白质组学、转录组学以及疾病等信息，其界面友好，方便用户使用。STRING数据库是目前使用最广泛的进行已知和预测蛋白质-蛋白质相互之间作用关系的数据库。

1.4 靶基因基因本体（gene ontology，GO）和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析利用DAVID[11]（https://david.ncifcrf.gov/）及STRING数据库将获取的所有关键活性成分靶标进行生物信息学在线分析，包括GO分析和通路分析：对靶标基因进行GO注释，并计算每条GO项目的P值，以P＜0.05为标准筛选出显著性富集的GO项目，获得GO相关生物学过程、分子功能、细胞成分等；对靶标进行KEGG通路注释，得到其所参与的通路及每条通路的P值，以P＜0.05为标准筛选出显著性通路，最终得到与同种异体移植排斥的相关通路。DAVID数据库是目前使用最广泛的可对大量基因背后的生物学含义进行全面功能注释的在线工具。

1.5 中药-活性成分-靶标-移植排斥的网络构建及分析 对活血化瘀中药活性成分与同种异体移植排斥靶标之间的复杂关系进行网络分析。利用蛋白质-蛋白质相互作用信息，将得到的活血化瘀中药关键化学活性成分、关键活性成分的靶标、重要的同种异体移植排斥靶标及相互作用的蛋白连接在一起，以构建中药-活性成分-靶标-移植排斥网络。使用Cytoscape 3.3.0对网络进行可视化和分析，并使用Cytoscape软件的NetworkAnalyzer APP计算每个节点的拓扑特征。将具有较高“连接度（degree）”、“介数（betweenness centrality）”的网络节点识别为同种异体移植排斥的候选活血化瘀中药的核心靶标[9]。

2 结果

2.1 活血化瘀中药活性成分的筛选 32味活血化瘀中药经BATMAN-TCM检索后总共获得922个相关活性化合物，得到503个独立的具有化学结构的化学活性成分，其中最主要的9种活性成分具体见表1，可知活血化瘀类中药具有一些共同的化学活性成分，且姜黄、郁金、川芎3种中药是活血化瘀中药含有主要活性成分的代表中药。

表1 活血化瘀中药主要含有的活性成分

2.2 活血化瘀中药关键活性成分靶标的筛选 经BATMAN-TCM检索后共获取相关化学活性成分预测的相关靶标5 224个，独立靶标共554个。经PALM-IST工具检索到与同种异体移植排斥相关的靶基因共2 397个（共10 960篇摘要），经GeneCards检索到相关的靶基因共1 679个，将得到的靶标去掉重复基因最后得到同种异体移植排斥靶基因共704个。经Cytoscape 3.3.0软件将704个同种异体移植排斥靶基因与554个活血化瘀中药活性成分靶基因匹配后共筛选出67个关键靶基因，选择较高的连接度中位数的3倍（连接度≥12）和介数获得关键17个靶基因，见表2。进一步使用STRING工具获取17个关键靶标之间的相互作用关系（选择最低互相关系得分0.4），共获取44个互相关系，见图1。

2.3 生物GO富集及通路分析 经DAVID工具对17个预测关键靶基因进行GO富集后，共获得52条生物学含义富集结果，其中包括生物学过程41项，分子功能8项，细胞成分3项，主要的GO生物学过程富集结果见表3，可见多条相关生物学过程均与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡等过程相关。进一步进行KEGG的通路分析，得到主要的16条通路见图2，可见核因子κB（NF-κB）信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路主要参与活血化瘀中药活性成分作用于同种异体移植排斥的相关药理机制。

2.4 中药-活性成分-靶标-移植排斥网络分析 根据筛选出来的活血化瘀中药关键26种活性成分的17个核心靶标及其网络拓扑参数，利用Cytoscape 3.3.0软件构建中药-活性成分-靶标-同种异体移植排斥网络图（图3）。进一步利用药理网络分析关键活血化瘀活性成分作用于同种异体移植排斥的相关药理机制可能是活血化瘀中药的活性成分主要是萜类化合物包括如莪术二酮（Curdione）、香芹酮（Carvone）、丹参新酮（Miltirone）、百里酚（Thymol）、姜黄酮（Turmerone）等通过 NF-κB 信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路以及PPAR信号通路作用于 PTGS2、LTA、ATM、TNF、APOA2、PPARG、IL-13、IL-1B靶标从而改善同种异体移植排斥反应，见图4。

表2 关键活性成分17个核心靶基因

图1 关键17个靶基因间相互作用关系

表3 关键靶基因主要生物学过程

图2 关键靶标的潜在信号通路

图3 核心中药-活性成分-靶标-移植排斥网络药理图（关键17个靶标）

图4 活血化瘀中药活性成分作用于同种异体移植排斥的药理机制

3 讨论

众所周知，免疫排斥反应是限制同种异体器官移植的主要原因，细胞免疫是免疫排斥反应的主要启动机制。细胞免疫中T淋巴细胞在移植免疫排斥中起着关键作用。T细胞中的辅助性T（T help，Th）细胞包含不同的亚群[12-13]，主导细胞免疫，主要分泌IL、干扰素（Interferon，IFN）等细胞因子，其中Th1主要分泌IFN-γ等，Th2主要分泌 IL-4、IL-5等，Th17主要分泌 IL-17A、IL-22以及IL-13等[14]。Th1细胞是参与移植免疫应答的主要免疫细胞，而Th2细胞对移植排斥反应有一定的调节作用，Th17细胞可能在一定程度上也参与了移植排斥反应，IL-17在移植排斥中大量分泌也促使移植排斥反应[15-16]。因此靶向IL-17可抑制同种异体移植排斥反应。而由抗体介导的体液免疫也参与移植排斥反应，其中包括慢性排斥系统炎症反应，例如NF-κB通路也参与其中等[17-18]。另外，目前的相关研究显示TNF受体及相关分子可控制淋巴器官的发育，影响T细胞和抗原递呈细胞的活化和存活，并改变细胞因子和趋化因子的产生[19]。且越来越多的数据表明肿瘤坏死因子受体（TNFR）/TNF超家族成员对移植免疫中发挥作用的CD8+T细胞的功能尤为重要，可见其在移植排斥中具有重要作用[20]。因此靶向TNFR/TNF超家族分子的策略似乎很有可能用于控制或预防移植器官和组织的排斥反应。可见本研究挖掘的IL-17、TNF以及NF-κB信号通路及相关靶标如IL-13、IL-1B、TNF等与移植排斥机制紧密相关，作用于其信号通路及靶标将成为抗同种异体移植排斥药物开发的重要策略。

我国临床器官移植已开展五十余年，中医药及其活性化合物被用于抗器官移植排斥及减少免疫抑制剂的毒副反应，且取得一定的疗效。常用的中药如雷公藤中分离出来的雷公藤多甙包括萜类化合物雷公藤甲素以及冬虫夏草中提取的FTY-720均证明可有效抑制临床患者移植排斥反应，可协同免疫抑制剂发挥抑制器官移植排斥且同时降低免疫抑制剂的毒副反应，已成为新的免疫抑制剂[21-23]。另外多个主要活血化瘀中药活性成分也都在抗器官移植排斥中发挥作用，如苏木提取物苏木素A可延长大鼠心脏移植物的存活，从而减弱大鼠心脏同种异体移植的急性排斥反应[24]；川芎嗪可联合小剂量环孢素（cyclosporine，CsA）抑制小肠移植急性排斥反应更佳[25]；姜黄素具有免疫抑制作用，在BN-WKY模型大鼠中单用姜黄素14d可将其平均生存时间由9.1d延长至20.5～24.5d，联合姜黄素和CsA可延长至28.5～35.6d，比单用CsA效果好[26]；笔者也证实了相关活血化瘀中药活性成分山奈酚（Kaempferol）可通过提高叉头状螺旋转录因子3表达而增加调节性T细胞（Treg）数量以协助小剂量CsA更好发挥免疫抑制作用，从而最大限度降低CsA的不良反应[27]；Lu等[28]也发现丹参素（Tanshinol）可显著延迟小鼠同种异体移植心脏排斥反应，并与雷帕霉素（Rapamycin）发挥协同作用延长小鼠同种异体心脏移植物的存活时间。因此，本研究挖掘出了作用于同种异体排斥反应的主要活血化瘀中药包括川芎、丹参、姜黄、莪术、郁金等，且预测了其可能发挥作用的主要活性化合物，这将有助于进一步挖掘出对器官移植排斥有效的免疫抑制新药，以及可改善免疫抑制剂毒副反应的辅助新药。

为了揭示对疾病和涉及药物的活性物质的相关作用，本研究进行了网络药理学分析，以研究活血化瘀中药作用于同种异体移植排斥的相关药理机制。通过网络药理学方法，笔者从分子或系统水平构建活性化合物与蛋白质/基因靶标之间相互作用的生物网络，预测了与同种异体移植排斥相关的活血化瘀中药活性成分和潜在靶标。预测结果表明活血化瘀中药26种活性成分与17个与同种异体移植排斥相关的靶标相互作用。结果提示一些活性成分可以同时调节相同的靶标，这很好地解释了中药的协同机制。值得一提的是，计算模型只能给出提示与预测，仍然需要通过实验进行验证。对中药药理机制的理解是其现代化的必要条件，网络药理学的综合和整体思想与中药整体观的本质是一致的。因此，网络药理学可以被认为是预测和发现治疗特定疾病的新药研发的有效方法，这将为揭示中医药的作用机制提供新的策略。