自噬与2型糖尿病牙周炎的组织学和细胞学研究

王芳 赵玉红 张海云 何萍 吴红霞 吴鸣蕾 胡济安

糖尿病是与遗传和自身免疫相关的全身性慢性代谢性疾病，炎症在2型糖尿病发病机制中的作用备受关注。牙周炎使牙周组织处于炎症环境，炎症引起胰岛细胞结构和功能障碍，可导致2型糖尿病发生[1]。2型糖尿病与牙周炎相互作用又相互促进[2]。自噬是细胞在自噬相关基因的调控下发生、发展、老化、死亡过程中存在的一个自我消化和再循环系统[3]。细胞通过自噬降解蛋白质和受损的细胞器。自噬在基础状态和应激情况下对胰岛细胞数量、结构和功能均发挥了重要的作用，在糖尿病的发生、发展中起到重要作用。自噬相关蛋白ATG5/ATG1可以与干扰素（IFN）中的IFN-β结合而阻断IFN的信号通路[4]。自噬发生过程中有两个类泛素化修饰过程，分别发生在ATG5-ATG12系统和微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated proteins light chain 3，LC3）系统中，对于自噬泡的延伸与自噬体的成熟有重要意义。自噬关键调控蛋白复合物Beclin1是ATG6的同系，通过调节蛋白质的合成和降解以及细胞器的更新来维持细胞稳态，Beclin1与多种急、慢性疾病的发生密切相关[5]。自噬受体蛋白（Sequestosome-1，P62）为髓细胞病毒基因C的表达产物，转录调控的靶基因参与细胞周期的调控、增殖、凋亡及永生化等过程，在诸多自噬和炎症的发生中起着重要作用[6]。LC3是自噬的生物标志物[7]，自噬形成时，其与磷脂酰乙醇胺共价结合，结合在自噬体膜上的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可评估自噬水平的高低。基于此，本研究通过组织学和细胞学研究检测并比较 ATG1、ATG12、LC3、P62、Beclin1 在正常牙龈黏膜组织、口腔慢性牙周炎组织和2型糖尿病牙周炎稳定期组织中的表达差异，探讨自噬对2型糖尿病牙周组织的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织来源 组织标本选取自2015年1月至2019年6月在杭州市余杭区第五人民医院经手术切除并经病理学检查确认的5例口腔慢性牙周炎患者（其中男3例，女2例；年龄46～65岁）和5例2型糖尿病牙周炎稳定期患者（其中男2例，女3例；年龄48～63岁）的翻瓣黏膜组织。另择在杭州市余杭区第五人民医院种植牙的5例患者（其中男3例，女2例；年龄47～59岁）的正常牙龈黏膜组织（种植牙修建的边缘牙龈黏膜组织）作为对照。本研究经杭州市余杭区第五人民医院医学伦理委员会批准，受试者知情同意并签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂 ATG1、ATG12、P62鼠源单克隆（美国 Invitrogen公司），LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ，Beclin1兔源多克隆抗体（美国Sigma公司），波形蛋白Vimentin（北京中杉金桥公司）；广谱细胞角蛋白Ck（pan）（北京中杉金桥公司）；DMEM培养基（美国Gibico公司）；胰蛋白酶（美国Gibico公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH（美国Thermo公司），免疫组化SP试剂盒（北京中杉金桥公司）；兔抗鼠FITC-IgG、羊抗兔FITC-IgG等（北京中山生物技术有限公司）。DAB显色剂（福州迈新生物技术开发有限公司），MTT试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.1.3 主要仪器 倒置相差显微镜ckx41（日本Olympus公司）；CO2培养箱水套式 s-a305714-7787（美国Thermo公司）；紫外分光光度计UV1206（日本Shimodzu公司）；凝胶扫描系统DF23B（英国UVP公司）；电泳系统Mini Protean（美国Bio-Rad公司）；低温离心机5424R（美国Eppendorf公司）；倒置荧光显微镜Eclipse80i（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 组织块培养与细胞原代培养 无菌条件下刮取正常牙龈黏膜、口腔慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎稳定期翻瓣黏膜组织行体外培养，参照文献[8]进行组织块法原代培养。盖玻片+组织块培养原代细胞，并作常规传代培养，取2代细胞经免疫细胞化学检测呈Vimentin阳性、Ck（pan）阴性，则证实细胞来源于中胚层。牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞经肿瘤坏死因子α（TNF-α）阳性证实炎症存在，进行后续实验。

1.2.2 正常牙龈黏膜组织、慢性牙周炎组织和2型糖尿病牙周炎稳定期组织 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 表达情况检测 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法。将 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 一抗分别加入3种组织切片，再加入用生物素标记的二抗与一抗结合，使用SP放大系统产生低背景、高放大效果来测定组织细胞中的抗原。抗原修复采用高温高压法，抗原修复用EDTA抗原修复液，一抗反应为37℃、2h，免疫组化以抗 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 抗体染色细胞的细胞核或细胞质呈棕黄色颗粒状着色为阳性表达。

1.2.3 正常牙龈、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-II、LC3-I表达情况检测分别将1×106个/ml对数生长期的正常牙龈、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞悬液接种于底部铺有盖玻片的6孔培养板内，37℃、5%CO2饱和湿度下培养24h，加入ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ一抗，以加入PBS作为阴性对照；24h后，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定后，按免疫细胞化学试剂盒说明书进行操作检测表达情况。

1.2.4 正常牙龈、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞 ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达水平检测 采用Western blot法。将正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞接种于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度下培养，每1～2d换液1次。取对数生长期细胞，经4℃胞浆蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12 000g、4℃离心10min；沉淀后加入4℃预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1h，再12 000g 4℃离心30min；取上清液为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量，GAPDH为内参。核蛋白中加入等体积上样缓冲液煮沸5min，进行凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜后用5g/L牛血清白蛋白室温下封闭 2 h，分别用 ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ抗体4℃孵育过夜，用PBS充分洗涤，再加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠（1∶5 000）或羊抗兔IgG（1∶5 000）。结果使用Motic图像分析系统测量平均灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常牙龈黏膜组织、慢性牙周炎组织和2型糖尿病牙周炎稳定期组织 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 表达情况 正常牙龈黏膜组织、慢性牙周炎组织和2型糖尿病牙周炎稳定期组织中 ATG1、ATG12、Beclin1、P62免疫组化染色结果显示ATG1、ATG12表达相似，在正常牙龈黏膜组织中呈强阳性表达，在慢性牙周炎组织中呈弱阳性表达，在2型糖尿病牙周炎稳定期组织中呈阳性表达。Beclin1在正常牙龈黏膜组织中呈强阳性表达，在慢性牙周炎组织中呈弱阳性表达，在2型糖尿病牙周炎稳定期组织中呈阳性表达。P62在正常牙龈黏膜组织中呈弱阳性表达，在慢性牙周炎组织中呈弱阳性表达，在2型糖尿病牙周炎稳定期组织中呈阳性表达，见图 1-12（插页）。

2.2 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞 ATG1、ATG12、P62、Beclin1表达情况 ATG1、ATG12在正常牙龈成纤维细胞中强阳性表达，在慢性牙周炎成纤维细胞中弱阳性表达，在2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中弱阳性表达。P62在正常牙龈成纤维细胞弱阳性表达，在慢性牙周炎成纤维细胞中表达增高，在2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中表达更高。Beclin1在正常牙龈成纤维细胞中强阳性表达，在慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中弱阳性表达，见图13（插页）。

图1 ATG1在正常牙龈黏膜中强阳性表达（免疫组化染色，×200）

图2 ATG1在慢性牙周炎组织中弱阳性表达（免疫组化染色，×200）

图3 ATG1在2型糖尿病牙周炎稳定期组织中阳性表达（免疫组化染色，×200）

图4 ATG12在正常牙龈黏膜中强阳性表达（免疫组化染色，×200）

图5 ATG12在慢性牙周炎组织中弱阳性表达（免疫组化染色，×200）

图6 ATG12在2型糖尿病牙周炎稳定期组织中阳性表达（免疫组化染色，×200）

图7 Beclin1在正常牙龈黏膜组织中强阳性表达（免疫组化染色，×200）

图8 Beclin1在慢性牙周炎组织中弱阳性表达（免疫组化染色，×200）

图9 Beclin1在2型糖尿病牙周炎稳定期组织中阳性表达（免疫组化染色，×200）

图10 P62在正常牙龈黏膜中弱表达（免疫组化染色，×200）

图11 P62在慢性牙周炎组织中阳性表达（免疫组化染色，×200）

图12 P62在2型糖尿病牙周炎稳定期组织中阳性表达（免疫组化染色，×200）

图13 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达情况（注：a：ATG1在正常牙龈成纤维细胞中强阳性表达；b：ATG1在慢性牙周炎成纤维细胞中弱表达；c：ATG1在2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中弱表达；d：ATG12在正常牙龈成纤维细胞中强阳性表达；e：ATG12在慢性牙周炎成纤维细胞中弱表达；f：ATG12在2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中弱表达；g：P62在正常牙龈成纤维细胞弱阳性表达；h：P62在慢性牙周炎成纤维细胞中弱阳性表达；i：P62在2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中弱阳性表达；j：Beclin1在正常牙龈成纤维细胞中强阳性表达；k：Beclin1在慢性牙周炎成纤维细胞中弱阳性表达；l：Beclin1在2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中弱表达；免疫荧光染色，×200）

2.3 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达水平比较 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。2型糖尿病牙周炎成纤维细胞LC3-Ⅱ表达水平＞慢性牙周炎成纤维细胞＞正常牙龈成纤维细胞（均P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值＜慢性牙周炎成纤维细胞＜正常牙龈成纤维细胞牙周炎成纤维细胞（均P＜0.05），见图14、表1。

图14 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达电泳图

表1 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达水平比较

2.4 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表达水平比较 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表达水平比较差异均有统计学意义（均 P＜0.05）。ATG1、ATG12、P62在 2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中表达水平最低（均P＜0.05），Beclin1在2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中表达水平最低高（均P＜0.05），见图 15、表 2。

图15 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表达电泳图

表2 正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表达水平比较

3 讨论

2016年诺贝尔生理学医学奖授予发现了细胞自噬机制的Yoshinori Ohsumi，自噬是细胞降解和回收其成分物的过程[9]。自噬过程往往与机体多种代谢性疾病的发生直接相关，如2型糖尿病和糖尿病合并症等。研究者认为，自噬是细胞进行质量控制的一种特殊方式，如果无法进行有效的自噬过程，细胞就无法自我更新，从另一方面来讲，如果自噬过多，也会破坏细胞自身组分的平衡，进而诱发细胞死亡，因此适度调节的自噬过程对于维持机体健康至关重要[10]。尽管自噬作用的错误调节可能与多种疾病有关，其中包括它在胰腺β细胞和葡萄糖代谢过程中的作用并未有一致性的结论[11]。有学者利用特异性去除Atg7基因胰腺β细胞的小鼠进行研究，发现Atg7变异的小鼠表现出葡萄糖耐量减低以及血清胰岛素浓度的降低。由于细胞凋亡的增加以及β细胞分裂增生程度的降低，导致β细胞数量和胰腺中胰岛素的减少[12]。

慢性牙周炎组织和2型糖尿病牙周炎稳定期组织中，常规显微镜下可以观察到炎症的浸润方式和血管扩张的形态稍有不同，单纯细菌引起的慢性牙周炎，炎症细胞聚集于结合上皮和沟内上皮下方，下方固有层内血管扩张，而2型糖尿病伴发的牙周炎中炎症细胞沿着固有层扩张的血管内壁和上皮钉突的下方。有研究证实自噬在牙周膜细胞的分化中起作用[13]。本研究首先通过免疫组化检测正常牙龈黏膜组织、慢性牙周炎组织和2型糖尿病牙周炎稳定期组织中 ATG1、ATG12、Beclin1、P62的表达，染色结果显示ATG1、ATG12、Beclin1表达模式相似，在正常牙龈黏膜组织中呈强阳性表达，在慢性牙周炎组织中呈弱阳性表达，在2型糖尿病牙周炎稳定期组织中的表达接近慢性牙周炎组织，阳性表达介于正常牙龈黏膜组织和慢性牙周炎组织之间。P62的表达和ATG1、ATG12、Beclin1表达相反。接着本研究选取组织的原代细胞，对照组织学进行了细胞学研究。结果表明ATG1、ATG12、Beclin1、P62在正常牙龈成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞和2型糖尿病牙周炎成纤维细胞中的表达方式与其在组织中的表达相似，提示口腔慢性牙周炎稳定期和2型糖尿病牙周炎稳定期患者牙龈黏膜细胞自噬减弱。

LC3是检测自噬水平的标志性蛋白，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，当细胞内自噬水平升高时，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增加，进而使LC3-Ⅱ的含量增多[14]。因此通过检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值的变化可反映自噬体数目或自噬水平的变化。生理学分析显示，在小鼠中存在血糖激发的胰岛素分泌的降低，并且自噬作用缺陷的β细胞中血糖诱导的细胞内钙离子瞬变过程也被破坏。而形态学分析则表明存在泛素蛋白的聚集，这种现象与P62共存，并伴随着线粒体肿胀、内质网膨胀以及β细胞液泡的变化。以上研究结果表明自噬作用对于维持胰腺β细胞的结构、数量以及功能都是非常重要的，自噬作用的破坏将导致胰岛素的缺乏以及高糖血症的发生[15]。

本研究应用Western blot定量分析各组细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值变化，同时检测自噬相关蛋白ATG1、ATG12、Beclin1、P62蛋白表达，提示2型糖尿病牙周炎成纤维细胞比正常牙龈的成纤维细胞自噬降低，与非糖尿病牙周炎相比也有所下降，表明自噬参与牙周炎过程，并且与2型糖尿病自噬可能有协同作用。有学者发现了糖尿病小鼠以及高脂饮食小鼠的胰腺β细胞中存在自噬作用的升调节，能导致糖尿病相关的外周胰岛素抵抗的游离脂肪酸诱导胰腺β细胞自噬作用发生。对于atg7基因的消除将导致胰岛退化、胰岛素分泌以及葡萄糖耐量降低。与此同时研究人员还观察到，尽管在对照组小鼠中高脂肪含量的饮食能激发胰腺β细胞自噬，但是对于自噬不足变异小鼠而言，这将形成葡萄糖耐量的恶化，以上现象发生的部分原因在于缺乏胰腺β细胞数量的补偿性增加[16]。另有研究表明，当存在高脂肪饮食诱导的胰岛素抵抗时，自噬作用是一种胰腺β细胞的独特适应性反应。因此，基础自噬作用对于维持正常的胰岛结构和功能至关重要[17]。

综上所述，本研究发现自噬与2型糖尿病牙周炎的发生存在复杂关系，在口腔慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎稳定期自噬呈现下降。细胞自噬在2型糖尿病这一代谢性疾病中扮演了重要角色。如能找到引发2型糖尿病牙周炎异常自噬过程的靶点，以此来研发新型治疗方法，或能助于疾病的早期诊断并预防多种代谢性疾病的发生。