脂肪细胞增强子结合蛋白1在胶质瘤中高表达及与患者预后的关系

程礼敏，陈三送，吴明彩，鲁亚平

(1.皖南医学院 形态学实验实训中心，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 神经外科，安徽 芜湖 241001；3.皖南医学院 生物化学与分子生物学教研室，安徽 芜湖 241002；4.安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000)

胶质瘤是人脑中最常见的恶性肿瘤，尽管随着治疗手段及技术的发展，疗效仍不满意，尤其是胶质母细胞瘤，经联合治疗后患者的中位生存期仍然只有14.6个月，5年生存期仅为5.5%[1]。因而，迫切需要锁定调控胶质瘤恶性增殖的关键分子，对于开辟靶向治疗胶质瘤新途径具有重要临床意义。脂肪细胞增强子结合蛋白1(adipocyte enhancer binding protein1, AEBP1)最初被认为是一种负调控脂肪生成的转录抑制因子[2],但最近的研究发现AEBP1上调与卵巢癌和膀胱癌患者预后不良有关[3-4]。但其在胶质瘤中的表达情况及其和胶质瘤患者预后是否同样相关，鲜有报道。本研究旨在探讨AEBP1在胶质瘤组织的表达情况，分析其与胶质瘤患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas, TCGA)是国外目前最大的癌症基因信息数据库，包含了各种癌症的生物信息资料。中国脑胶质瘤基因谱数据库(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)是包含有数百例胶质瘤患者齐全的生物信息资料的数据库。本研究分析了CGGA 数据库中数百例胶质瘤患者以及TCGA数据库中正常脑组织207例、较低级别胶质瘤518例、高级别胶质瘤(胶质母细胞瘤)163例中AEBP1的表达情况。通过GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析数据结果、绘制生存曲线。

1.2 临床标本 为验证AEBP1在胶质瘤组织中表达情况，我们选用了弋矶山医院神经外科手术中取得的临床标本，其中正常脑组织6例(重型颅脑损伤内减压术中获得)，低级别胶质瘤14例，胶质母细胞瘤15例，标本于-196℃液氮保存。所有入选患者或患者家属均签署知情同意书，同意参与科研项目，本研究获得医院伦理委员会批准。

1.3 主要试剂 实时荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司，RNA抽提试剂盒及逆转录试剂盒分别购买于Invitrogen公司、Fermentas公司。AEBP1一抗购买于Abcam公司 ，二抗购买于南京讯贝生物科技公司。Western blot 试剂购买于北京普利莱公司。

1.4 实时定量PCR 采用RNA提取试剂盒提取全部RNA，反转录构建cDNA，荧光定量PCR检测AEBP1 mRNA的表达水平。引物序列如下：上游引物(F)：5-ACCCACACTGGACTACAATGA-3，下游引物(R)： 5-GTTGGGGATCACGTAACCATC-3。AEBP1 mRNA的相对表达水平采用2-△△CT方法分析。

1.5 Western blot 从细胞中提取总蛋白，用BCA检测试剂盒定量。用10% SDS-PAGE凝胶分离蛋白样品，转移到PVDF膜上。然后将膜与一抗在4℃处孵育过夜。次日孵育HRP标记的二抗，使用ECL 曝光检测，Image J软件分析蛋白灰度值。

2 结果

2.1 AEBP1在胶质瘤组织中高表达且与胶质瘤级别、IDH突变、1p/19q联合缺失相关 通过GEPIA网站挖掘出TCGA数据库中AEBP1在胶质瘤组织及正常脑组织的表达情况，结果发现AEBP1在胶质母细胞瘤中相对于正常脑组织高表达，差异具有统计学意义(P=0.010)，而在较低级别胶质瘤中差异无统计学意义(P=0.220)。CGGA数据库数据显示AEBP1在WHO Ⅱ～Ⅳ级中随着肿瘤级别增高，表达逐级增高，且在IDH野生型组织中表达均高于IDH突变型，差异均具有统计学意义(P<0.05)。所有级别胶质瘤类型中，AEBP1在非1 p/19 q联合缺失型组织中表达高于1 p/19 q联合缺失型，差异具有统计学意义(P=0.000)。在WHO Ⅲ、Ⅳ级中，AEBP1在非1 p/19 q联合缺失型组织中表达高于1 p/19 q联合缺失型，差异均具有统计学意义(P<0.05)，但在WHO Ⅱ中，差异无统计学意义(P=0.300)，见表1 。

表1 AEBP1在胶质瘤的表达及与肿瘤级别、IDH突变、1p/19q联合缺失的关系

类别AEBP1相对表达量F/tP正常脑组织(n=207)4.01±0.91a359.3300.000较低级别胶质瘤(n=518)4.92±1.32a胶质母细胞瘤(n=163)7.25±1.05bWHO Ⅱ(n=103)4.33±1.55a38.6200.000WHO Ⅲ(n=79)5.25±1.83bWHO Ⅳ(n=139)6.29±1.78cIDH突变型(n=175)4.43±1.482.0190.000IDH野生型(n=149)6.56±1.71WHO Ⅱ IDH突变型(n=90)4.17±1.393.0960.003IDH野生型(n=12)5.59±2.15WHO ⅢIDH突变型(n=43)4.42±1.534.9920.000IDH野生型(n=36)6.23±1.68WHO ⅣIDH突变型(n=41)5.05±1.465.9190.000IDH野生型(n=98)6.80±1.641p/19q联合缺失型(n=67)4.42±1.084.9400.0001p/19q非联合缺失型(n=250)5.68±2.01WHO Ⅱ 1p/19q联合缺失型(n=44)4.50±0.941.0280.030 非1p/19q联合缺失型(n=58)4.21±1.90WHO Ⅲ1p/19q联合缺失型(n=16)4.11±1.292.9980.004 非1p/19q联合缺失型(n=62)5.57±1.83WHO Ⅳ1p/19q联合缺失型(n=7)4.58±1.372.7180.007 非1p/19q联合缺失型(n=129)6.41±1.75

注：多组间两两比较，符号不同表示P<0.05。

2.2 临床标本证实AEBP1mRNA及蛋白在胶质瘤中高表达 实时定量PCR检测AEBP1mRNA在低级别胶质瘤、胶质瘤母细胞瘤中表达高于正常脑组织，差异均具有统计学意义(P<0.05，表2)。Western blot显示AEBP1蛋白在胶质母细胞瘤组织中表达水平均高于正常脑组织，且差异均具有统计学意义(P<0.05，图1、表2)。

2.3 AEBP1在胶质瘤中高表达预示患者预后不良 TCGA数据库生存分析显示，无论是在所有胶质瘤患者病例中，还是在较低级别胶质瘤患者中，AEBP1高表达均具有相对短的无病生存期，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2a、2b)，但在高级别胶质瘤患者病例中除外(P=0.086)(图2c)；且AEBP1高表达均具有相对短的总生存期(图2d、2e、2f)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

Normal为正常脑组织，GBM为胶质母细胞瘤，GAPDH为内参。

图1 Western blot检测临床标本中AEBP1蛋白的表达

表2 临床标本中AEBP1mRNA及蛋白相对表达量

组织类型AEBP1mRNA相对表达量AEBP1蛋白表达量(灰度值)正常脑组织(n=6)0.98±0.01a0.42±0.05较低级别胶质瘤(n=14)2.15±0.12b-胶质母细胞瘤(n=15)4.02±0.07c1.05±0.01F/t2998.41648.219P0.0000.000

注：多组间两两比较，符号不同表示P<0.05。

a、b、c分别为AEBP1高表达与所有胶质瘤患者(P=0.000)、较低级别胶质瘤患者(P=0.003)、高级别胶质瘤患者(P=0.086)无病生存期的关系，d、e、f分别为AEBP1高表达与所有胶质瘤患者(P=0.000)、较低级别胶质瘤患者(P=0.000)、高级别胶质瘤患者(P=0.000)总生存期的关系。

图2 TCGA数据库中AEBP1高表达与生存期的关系

3 讨论

虽然随着手术技术及辅助治疗的发展，胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤的远期治疗效果没有得到很大的提高。其中一个重要原因就是缺乏早期的、特异性的、灵敏的生物学诊断指标[5]。既往大量的研究表明，胶质瘤的发生、发展与多种肿瘤信号通路激活、靶分子基因突变等相关[6]；因而，寻找调控胶质瘤恶性增殖的靶分子及信号通路，可能成为预测胶质瘤预后的生物学指标以及靶向治疗胶质瘤的新靶点。

AEBP1又称AE结合蛋白，是编码羧肽酶a蛋白家族的一个成员[7]。编码蛋白作为转录抑制因子，在脂肪生成和平滑肌细胞分化中发挥作用，最初被认为是一种负调控脂肪生成的转录抑制因子[2]。另外研究表明AEBP1可以调节阿尔茨海默病的发展并且在调节NF-κB信号通路中起重要作用[8-9]。近年来更有研究表明AEBP1表达上调后通过激活NF-κB信号通路，进而影响到卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌患者的预后[3-5]。然而，对于AEBP1在胶质瘤组织中的表达情况及其是否也通过NF-κB信号通路参与胶质瘤的恶性进展等鲜有报道。

笔者通过分析TCGA及CGGA数据库数据显示AEBP1在胶质瘤组织中相对于正常脑组织高表达，且随着胶质瘤分级的增高表达逐级增高。另外，AEBP1在IDH野生型、非1p/19q联合缺失型中表达分别高于IDH突变型及1p/19q联合缺失型。近年来的研究已经发现IDH突变的胶质瘤患者较野生型患者对放化疗更敏感，具有相对较好的临床预后[10-11]。1p/19q联合缺失是胶质瘤尤其是少突胶质细胞瘤重要的分子指标，研究同样发现1p/19q联合缺失的胶质瘤患者对含烷化剂的PCV化疗方案及TMZ更敏感，具有相对好的临床预后[12-13]。而AEBP1在IDH野生型、非1p/19q联合缺失型表达更高，提示其与胶质瘤患者的预后关系密切。这个结果与TCGA数据库生存分析结果完全吻合。本研究通过TCGA数据库数据绘制生存曲线发现，无论是在所有胶质瘤患者中，还是在较低级别胶质瘤患者中，AEBP1高表达均具有相对短的无病生存期。在高级别胶质瘤中无统计学意义，可能与高级别胶质瘤患者生存期更短、不能及时随访发现疾病复发以及患者最终死亡原因难以确定(是否死于合并症)等有关，这样影响到无病生存期的记录，带来误差。然而，总生存期曲线显示，无论在所有胶质瘤患者中，还是在低级别或是高级别胶质瘤患者中，AEBP1高表达的患者均具有相对短的总体生存期。这些结果提示AEBP1高表达预示胶质瘤患者预后更差。

笔者选用临床标本分别检测了AEBP1 mRNA及蛋白的表达水平，结果与数据库结论一致，并且结合数据库大样本生存分析更加说明了AEBP1在胶质瘤发生、发展中起重要作用。至于其是通过何种机制影响胶质瘤的恶性增殖、是否与NF-κB信号通路相关，本课题组正在进行下一步深入的研究。假如AEBP1是调控NF-κB信号通路中的关键分子，那么通过沉默它的表达，是否能抑制胶质瘤的生长、促进凋亡，是否能成为靶向治疗胶质瘤的关键因子，值得更深入研究与探讨。