高效液相色谱法测定不同形态化妆品中的5种防腐剂

2020-07-01邓廷玉

安徽化工 2020年3期

夏明，李赓，邓廷玉，刘晨

（1.合肥学院，安徽合肥230601；2.暨南大学，广东广州510632）

为抑制微生物生长，化妆品中常加入防腐剂。鉴于其对人体有一定的危害性，我国卫生部颁布了《化妆品卫生规范》（2007 版），允许在化妆品中使用的防腐剂为56种，其中较常用的有20～30种，并规定了其添加量范围。但一些不良厂商为牟取暴利，会随意扩大化妆品防腐剂的添加量和使用范围，使得我国化妆品市场比较混乱[1-3]。随着化妆品中防腐剂体系复杂程度日益扩大，为了规范化妆品市场，需要不断探索新的检测方法。

目前，化妆品市场上使用的防腐剂大多是单一防腐剂[4]，而复合型防腐剂有很多单一防腐剂没有的优点[5]。目前，化妆品市场使用复合型防腐剂成为一种趋势，过去的那些能够检测出单一防腐剂的方法，在目前的防腐体系下渐渐地失去了原有的价值，因此研究出能够简便快速测定多种防腐剂的方法至关重要。同时，市售化妆品大部分为质地粘稠的乳液形态，而大多数检测方法都需使用提取后的液态样品，因此，如何进行待测样品前处理也是目前存在的问题之一。

目前针对化妆品市场上常用的防腐剂检测方法有气相色谱法[6]、高效液相色谱法[7]、气相色谱-质谱法[8]、薄层色谱法[9]、毛细管电泳法[10]等，其中，高效液相色谱具有高效、简便、快捷等优点[11]。因此，本文使用高效液相色谱法对市售化妆品中最常见的5种防腐剂进行色谱条件优化并进行含量测定，从而实现了在较短时间内同时测定5种防腐剂，对规范和推动化妆品市场健康发展有所帮助。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

标准品，苯甲醇，化学对照品，中国食品药品检定研究院；苯氧乙醇，标准品，AccuStandard；对羟基苯甲酸甲酯，分析标准品，HPLC≥99%，源叶生物科技有限公司；苯甲酸，分析标准品，HPLC≥98%，源叶生物科技有限公司；对羟基苯甲酸丙酯，分析标准品，HPLC≥99%，源叶生物科技有限公司。

甲醇，色谱纯；四氢呋喃，色谱纯；甲酸，分析纯；磷酸二氢钠，分析纯；乙酸铵，分析纯；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。

10 种化妆品样品分别编号 1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#，1#～5#为液态化妆品，6#～10#为乳液态化妆品，均市购。

表1 主要设备一览表

1.2 仪器与设备（见表1）

1.3 色谱条件

色谱柱为 Phenomenex Luna C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，进样体积20 μL；流动相为甲醇（A）- 0.1%甲酸水溶液（B）；流速1.0 mL/min；检测波长为254 nm；梯度洗脱：0～2 min，15%～45%A；2～12 min，45%～70%A；12～20 min，70%～85% A。

1.4 标准溶液配制

（1）苯甲醇、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲酸、对羟基苯甲酸丙酯标准品储备液的制备

分别准确称取0.2 mg、50 mg、2 mg、25 mg、2 mg的苯甲醇、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲酸、对羟基苯甲酸丙酯标准品置于烧杯中，加甲醇溶解，全部溶解后，转移到10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，得到浓度分别为20 mg/L、5 000 mg/L、200 mg/L、2 500 mg/L、200 mg/L 的苯甲醇、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲酸、对羟基苯甲酸丙酯溶液。放置于冰箱保存，作为标准品储备液。

（2）标准品混合溶液的制备

分别量取1mL 苯甲醇、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲酸、对羟基苯甲酸丙酯标准品储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成标准品混合溶液，溶液中各防腐剂浓度分别为：苯甲醇2 mg/L，苯氧乙醇500 mg/L，对羟基苯甲酸甲酯20 mg/L，苯甲酸250 mg/L，对羟基苯甲酸丙酯20 mg/L。

1.5 样品处理

（1）市售化妆品样品溶剂的制备

准确量取7 mL 甲醇于试管中，加入3 mL 纯净水，混合均匀，制成甲醇与纯净水的体积比为甲醇-水混合溶液（70% V/V甲醇）。

（2）各种市售化妆品样品的前处理

准确量取1mL化妆品样品于10 mL容量瓶中，加入甲醇-水混合溶液（70% V/V甲醇）定容至刻度，混匀，取部分溶液至离心管中，恒温40℃水浴加热15 min，超声清洗15 min，在5 000 rpm 的条件下离心15 min。取上清液经孔径为0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供检测用。

（3）0.1%甲酸水溶液的制备

那天李老黑跟我谈话的时间并不长，可是内容非常重要，通过他的话，也让我终于明白，我实际是钻进了李老黑预先设的套子。我把那天李老黑的谈话内容简要记录如下，请各位读者自己判断：

准确量取0.5 mL 甲酸于500 mL 容量瓶中，用纯净水定容至刻度，移入蓝口瓶，超声清洗30 min，后进行抽滤，滤液待用。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

通过全波长扫描可知，苯氧乙醇的最大吸收波长是270 nm，苯甲醇的最大吸收波长是258 nm，苯甲酸的最大吸收波长是230 nm 和275 nm，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的最大吸收波长是260 nm，各防腐剂的全波长扫描图见图1。综合各物质的最大吸收波长，本文确定254 nm作为色谱条件的检测波长。

图1 5种防腐剂的紫外吸收光谱图

2.2 流动相体系的选择

采用甲醇-水体系（I）、甲醇-0.1%甲酸体系（II）、甲醇-0.025 mol/L 磷酸二氢钠体系（III）、甲醇-0.02 mol/L乙酸铵体系（IV）对5 种防腐剂的标准品混合溶液进行分离，结果见图2。由图2可知，在体系II和体系IV中均可使5种组分的色谱峰基线分离,且色谱峰无拖尾现象，但乙酸铵对皮肤、粘膜、咽喉、鼻腔和眼睛存在刺激性作用，有一定的健康危害，故最终选择体系II：甲醇(A) -0.1%甲酸(B)作为流动相。使用选定的最佳分离色谱条件对混合标准溶液进行梯度洗脱的色谱图如图2所示。

图2 不同流动相体系条件下的液相色谱图

2.3 样品提取溶剂的选择

考虑到乳液状化妆品的难溶解性，分别用100%甲醇，甲醇-水混合溶液（70% V/V 甲醇），甲醇-四氢呋喃混合溶液（33.3% V/V 甲醇）对乳液态化妆品（6#）进行溶解提取。恒温40℃水浴加热15 min，超声清洗15 min，在5 000 rpm 的条件下离心15 min。取上清液经孔径为0.22 μm 有机滤膜过滤后，在1.3 色谱条件下分析。结果如表2所示，在甲醇-水混合溶液中，9.393 min处的峰高和峰面积均为最大，说明乳液态化妆品在甲醇-水混合溶液（70% V/V 甲醇）中的溶解性最好，甲醇-四氢呋喃混合溶液（33.3% V/V 甲醇）与100%甲醇的提取效果均次之。因此，实验最终选择甲醇-水混合溶液（70%V/V甲醇）为乳液类化妆品的提取溶剂。

水剂类化妆品由于在3种提取条件下检测结果几乎相同，故选择较简便的100%甲醇进行提取，恒温40℃水浴加热15 min，超声清洗15 min，在5 000 rpm的条件下离心15 min。取上清液经孔径为0.22 μm有机滤膜过滤。

表2 不同提取方法对乳液类化妆品的提取效果

2.4 线性范围

在选定的最佳色谱条件下，测定各防腐剂的系列浓度溶液，以各组分的质量浓度x（mg/L）为横坐标,色谱峰的峰面积y 为纵坐标进行线性回归，得到的线性方程、相关系数r及线性范围见表3。结果表明，5种防腐剂在浓度范围内，其浓度与色谱峰面积均呈线性关系，且线性相关系数均大于0.994。

表3 5种防腐剂的线性方程、相关系数及线性范围

2.5 回收率和精密度

采用标准加入法测定方法的回收率。取已知防腐剂含量的样品（1#），加入适量的混合标准溶液，重复6次，测定其加标回收率和精密度，结果如表4所示。6次重复实验的回收率范围为94.5%～102.0%，精密度（RSD）范围为2.4～2.9，满足定量要求，方法的重复性和再现性较好。

表4 5种防腐剂的回收率和精密度

2.6 实际样品的测定

使用选定的最佳色谱分离条件对市售的10 种水剂类、乳液类化妆品样品进行分析，以各防腐剂标准样品的保留时间对化妆品中的防腐剂进行定性，以峰面积和标准曲线对防腐剂的含量进行定量分析。各化妆品中防腐剂的添加情况见表5。由结果可知，苯氧乙醇是市售化妆品中添加比率最高的防腐剂，且添加量较高，其次是对羟基苯甲酸甲酯，苯甲酸由于对人体有部分刺激性，在市售化妆品中添加比率最低。